Мікроскоп роздільна здатність. Мікроскоп як оптичний прилад. Роздільна здатність мікроскопа. Класифікація світлових мікроскопів Застосування ультрафіолетових променів
Світлова мікроскопія
Світлова мікроскопія забезпечує збільшення до 2-3 тисяч разів, кольорове та рухоме зображення живого об'єкта, можливість мікрокінозйомки та тривалого спостереження того самого об'єкта, оцінку його динаміки та хімізму.
Основними характеристиками будь-якого мікроскопа є здатність і контраст. Роздільна здатність - це мінімальна відстань, на якій знаходяться дві точки, що демонструються мікроскопом окремо. Роздільна здатність людського ока в режимі найкращого бачення дорівнює 0.2 мм.
Контраст зображення – це відмінність яскравостей зображення та фону. Якщо ця відмінність становить менше 3 - 4%, то його неможливо вловити ні оком, ні фотопластинкою; тоді зображення залишиться невидимим, навіть якщо мікроскоп дозволяє його деталі. На контраст впливають як властивості об'єкта, які змінюють світловий потік у порівнянні з фоном, так і здатності оптики вловити відмінності у властивостях променя.
Можливості світлового мікроскопа обмежені хвильовою природою світла. Фізичні властивості світла - колір (довжина хвилі), яскравість (амплітуда хвилі), фаза, щільність та напрямок поширення хвилі змінюються залежно від властивостей об'єкта. Ці відмінності використовуються у сучасних мікроскопах до створення контрасту.
Збільшення мікроскопа окреслюється добуток збільшення об'єктиву збільшення окуляра. У типових дослідницьких мікроскопів збільшення окуляра дорівнює 10, а збільшення об'єктивів – 10, 45 і 100. Відповідно, збільшення такого мікроскопа становить від 100 до 1000. Деякі з мікроскопів мають збільшення до 2000. Ще більш високе збільшення немає сенсу, оскільки у своїй роздільна здатність не покращується. Навпаки, якість зображення погіршується.
Числова апертура використовується для вираження роздільної здатності оптичної системи або світлосили об'єктива. Світлосила об'єктива -інтенсивність світла, що припадає на одиницю площі зображення, приблизно дорівнює квадрату NA. Розмір NA становить приблизно 0,95 для хорошого об'єктиву. Мікроскопи зазвичай розраховують таким чином, щоб його повне збільшення становило близько 1000 NA. Якщо між об'єктивом і зразком ввести рідину (масло або, що буває рідше, дистильовану воду), то вийде «імерсійний» об'єктив з величиною NA, що досягає 1,4, та з відповідним поліпшенням роздільної здатності.
Методи світлової мікроскопії
Методи світлової мікроскопії (освітлення та спостереження). Методи мікроскопії вибираються (і забезпечуються конструктивно) залежно від характеру та властивостей об'єктів, що вивчаються, оскільки останні, як зазначалося вище, впливають на контрастність зображення.
Метод світлого поля та його різновиди
Метод світлого поля в світлі, що проходить, застосовується при вивченні прозорих препаратів з включеними в них абсорбуючими (поглинаючими світло) частинками і деталями. Це можуть бути, наприклад, тонкі пофарбовані зрізи тварин і рослинних тканин, тонкі шліфи мінералів і т. д. Без препарату пучок світла з конденсора, проходячи через об'єктив, дає поблизу фокальної площини окуляра рівномірно освітлене поле. За наявності в препараті абсорбуючого елемента відбувається часткове поглинання і часткове розсіювання світла, що падає на нього, що і обумовлює появу зображення. Можливе застосування методу і при спостереженні неабсорбуючих об'єктів, але тільки в тому випадку, якщо вони розсіюють пучок, що висвітлює, настільки сильно, що значна частина його не потрапляє в об'єктив.
Метод косого освітлення – різновид попереднього методу. Відмінність з-поміж них у тому, що світло на об'єкт направляють під великим кутом до напряму спостереження. Іноді це допомагає виявити «рельєфність» об'єкта рахунок утворення тіней.
Метод світлого поля в відбитому світлі застосовується при дослідженні непрозорих об'єктів, що відбивають світло, наприклад шліфів металів або руд. Висвітлення препарату (від освітлювача та напівпрозорого дзеркала) проводиться зверху, через об'єктив, який водночас відіграє роль конденсора. У зображенні, створюваному в площині об'єктивом разом з тубусною лінзою, структура препарату видно з-за відмінності в її здатності елементів; на світлому полі виділяються також неоднорідності, що розсіюють падаючий на них світло.
Метод темного поля та його різновиди
Метод темного поля в світлі, що проходить (Dark-field microscopy) використовується для отримання зображень прозорих неабсорбуючих об'єктів, які не можуть бути видно, якщо застосувати метод світлого поля. Найчастіше це біологічні об'єкти. Світло від освітлювача та дзеркала направляється на препарат конденсором спеціальної конструкції – т.з. конденсор темного поля. Після виходу з конденсора основна частина променів світла, що не змінила свого напрямку при проходженні через прозорий препарат, утворює пучок у вигляді порожнистого конуса і не потрапляє в об'єктив (що знаходиться всередині цього конуса). Зображення в мікроскопі формується за допомогою лише невеликої частини променів, розсіяних мікрочастинками препарату, що знаходиться на предметному склі, всередину конуса і пройшли через об'єктив. Темнопольна мікроскопія заснована на ефекті Тиндаля (Tyndall effect), відомим прикладом якого є виявлення порошин у повітрі при освітленні їх вузьким променем сонячного світла. У полі зору темному тлі видно світлі зображення елементів структури препарату, що від довкілля показником заломлення. У великих частинок видно лише світлі краї, що розсіюють промені світла. Використовуючи цей метод, не можна визначити вид зображення, прозорі частинки чи непрозорі, більший чи менший показник заломлення вони мають проти навколишнім середовищем.
Проведення темнопільного дослідження
Предметне скло повинно бути не товще 1,1-1,2 мм, покривне 0,17 мм, без подряпин і забруднень. При приготуванні препарату слід уникати наявності бульбашок і великих частинок (ці дефекти будуть видно яскравими і не дозволять спостерігати препарат). Для темнопольної застосовують потужніші освітлювачі та максимальне напруження лампи.
Налаштування темнопольного освітлення в основному полягає в наступному:
Встановлюють світло Келером;
Замінюють світлопольний конденсор темнопольним;
На верхню лінзу конденсора наносять імерсійну олію або дистильовану воду;
Піднімають конденсор до зіткнення з нижньою поверхнею предметного скла;
Об'єктив малого збільшення фокусують препарат;
За допомогою центрувальних гвинтів переводять у центр поля зору світлу пляму (іноді має затемнену центральну ділянку);
Піднімаючи та опускаючи конденсор, домагаються зникнення затемненої центральної ділянки та отримання рівномірно освітленої світлої плями.
Якщо цього зробити не вдається, то треба перевірити товщину предметного скла (зазвичай таке явище спостерігається при використанні занадто товстого предметного скла - конус світла фокусується в товщі скла).
Після правильного налаштування світла встановлюють об'єктив потрібного збільшення та досліджують препарат.
В основі методу ультрамікроскопії лежить той же принцип – препарати в ультрамікроскопах висвітлюються перпендикулярно до напрямку спостереження. При цьому методі можна виявити (але не «спостерігати» в буквальному значенні слова) надзвичайно дрібні частинки, розміри яких лежать далеко за межами роздільної здатності найбільш сильних мікроскопів. За допомогою іммерсійних ультрамікроскопів вдається зареєструвати присутність у препараті частинок з частинок розміром до 2×10 -9 ступеня м. Але форму і точні розміри таких допомогою цього методу визначити неможливо. Їх зображення представляються спостерігачеві як дифракційних плям, розміри яких залежить немає від розмірів і форми самих частинок, як від апертури об'єктива і збільшення мікроскопа. Так як подібні частинки розсіюють дуже мало світла, то для їхнього освітлення потрібні надзвичайно сильні джерела світла, наприклад, вугільна електрична дуга. Ультрамікроскопи застосовуються в основному в колоїдній хімії.
Метод фазового розмаїття
Метод фазового розмаїття його різновид - т.з. Метод «аноптрального» розмаїття призначені для отримання зображень прозорих та безбарвних об'єктів, невидимих під час спостереження за методом світлого поля. До таких відносяться, наприклад, живі незабарвлені тваринні тканини. Суть методу в тому, що навіть при дуже малих відмінностях у показниках заломлення різних елементів препарату світлова хвиля, що проходить через них, зазнає різних змін по фазі (набуває фазовий рельєф). Ці фазові зміни за допомогою спеціального оптичного пристрою, що не сприймаються безпосередньо ні оком, ні фотопластинкою, перетворюються на зміни амплітуди світлової хвилі, тобто на зміни яскравості («амплітудний рельєф»), які вже помітні оком або фіксуються на фоточутливому шарі. Інакше кажучи, в видимому зображенні розподіл яскравостей (амплітуд) відтворює фазовий рельєф. Отримане таким чином зображення називається фазово-контрастним.
Фазово-контрастний пристрій може бути встановлений на будь-якому світловому мікроскопі і складається з:
Набір об'єктивів із спеціальними фазовими пластинками;
Конденсора з диском, що повертається. У ньому встановлені кільцеві діафрагми, що відповідають фазовим платівкам у кожному з об'єктивів;
Допоміжний телескоп для налаштування фазового контрасту.
Налаштування фазового розмаїття полягає в наступному:
Замінюють об'єктиви та конденсор мікроскопа на фазові (позначені літерами Ph);
Встановлюють об'єктив малого збільшення. Отвір у диску конденсора повинен бути без кільцевої діафрагми (позначеною цифрою "0");
Налаштовують світло Келером;
Вибирають фазовий об'єктив відповідного збільшення та фокусують його на препарат;
Повертають диск конденсора та встановлюють відповідну об'єктиву кільцеву діафрагму;
Для виявлення та дослідження мікроорганізмів застосовують мікроскопи. Світлові мікроскопи призначені вивчення мікроорганізмів, які мають розміри щонайменше 0,2 мкм (бактерії, найпростіші тощо.) a електронні вивчення більш дрібних мікроорганізмів (віруси) і дрібних структур бактерій.
Сучасні світлові мікроскопи- це складні оптичні прилади, поводження з якими потребує певних знань, навичок та великої акуратності.
Світлові мікроскопи поділяються на студентські, робочі, лабораторні та дослідні, що розрізняються за конструкцією та комплектацією оптикою.
Вітчизняні мікроскопи (Біолам", "Бімам", "Мікмед") мають позначення, що вказують, до якої групи вони відносяться (С – студентські, Р – робітники, Л – лабораторні, І – дослідні), комплектація позначається цифрою.
У мікроскопі розрізняють механічну та оптичну частини. Домеханічної частини
відносяться: штатив (що складається з основи та тубусодержателя) та укріплені на ньому тубус з револьвером для кріплення та зміни об'єктивів, предметний столик для препарату, пристосування для кріплення конденсора та світлофільтрів, а також вбудовані в штатив механізми для грубого (макромеханізм, макрогвинт) та тонкого
(мікромеханізм, мікрогвинт) переміщення предметного столика або тубусоутримувача.Оптична частина
Принципова схема мікроскопа та освітлювальної системи
1. Джерело світла;
2. Колектор;
3. Ірисова польова діафрагма;
4. Дзеркало;
5. Ірисова аппертурна діафрагма;
6. Конденбсор;
7. Препарат;
7". Збільшене дійсне проміжне зображення препарату, що утворюється; об'єктивом;
7"". Збільшене уявне остаточне зображення препарату, що спостерігається в окулярі;
8. Об'єктив;
9. вихідний значок об'єктива;
10. Польова діафрагма окуляра;
11. Окуляр;
12. Око.
Основну роль отриманні зображення грає об'єктив. Він будує збільшене, дійсне та перевернуте зображення об'єкта. Потім це зображення додатково збільшується при розгляданні його через окуляр, який аналогічно звичайній лупі дає збільшене уявне зображення.
Збільшеннямікроскопа орієнтовно можна визначити, помножуючи збільшення об'єктиву збільшення окуляра. Однак збільшення не визначає якість зображення. Якість зображення, його чіткість визначається роздільна здатність мікроскопа, Т. е. можливістю розрізняти окремо дві близько розташовані точки. Межа дозволу- Мінімальна відстань, на якій ці точки ще видно окремо, - залежить від довжини хвилі світла, яким освітлюється об'єкт, і числової апертури об'єктива. Числова апертура, у свою чергу, залежить від кутової апертури об'єктива та показника заломлення середовища, що знаходиться між фронтальною лінзою об'єктива та препаратом.
Кутова апертура це максимальний кут, під яким можуть потрапляти в об'єктив промені, що пройшли через об'єкт. Чим більше апертура і чим ближче показник заломлення середовища, що знаходиться між об'єктивом і препаратом, до показника заломлення скла, тим більша здатність здатність об'єктива. Якщо вважати апертуру конденсора рівної апертурі об'єктива, то формула роздільної здатності має такий вигляд:
де R - межа дозволу; - довжина хвилі; NA – числова апертура. Розрізняютькорисне імарна
збільшення. Корисне збільшення зазвичай дорівнює числової апертури об'єктива, збільшеної в 500-1000 разів. Більше високе окулярне збільшення не виявляє нових деталей і є марним.
Особливістю імерсійних об'єктивів є те, що між фронтальною лінзою такого об'єктиву і препаратом поміщають імерсійну рідину, що має показник заломлення такий самий, як скло (або близький до нього), що забезпечує збільшення числової апертури і роздільної здатності об'єктиву.
Як імерсійна рідина для об'єктивів водної імерсії використовують дистильовану воду, а для об'єктивів масляної імерсії-кедрове масло або спеціальне синтетичне іммерсійне масло. Використання синтетичного іммерсійного масла краще, оскільки його параметри більш точно нормуються, і воно на відміну від кедрового не засихає на поверхні фронтальної лінзи об'єктива. Для об'єктивів, що працюють в ультрафіолетовій області спектру, як імерсійну рідину використовують гліцерин. У жодному разі не можна користуватися сурогатами імерсійної олії і, зокрема, вазеліновим маслом.
**Зображення, отримане за допомогою лінз, має різні недоліки: сферичні і хроматичні аберації, кривизною поля зображення та ін. В об'єктивах, що складаються з декількох лінз, ці недоліки в тій чи іншій мірі виправлені. Залежно від ступеня виправлення цих недоліків розрізняють об'єктиви ахромати та складніші апохромати. Відповідно об'єктиви, в яких виправлена кривизна поля зображення, називаються планами і планами. Використання цих об'єктивів дозволяє отримати різке зображення по всьому полю, тоді як зображення, отримане за допомогою звичайних об'єктивів, не має однакової різкості у центрі та на краях поля зору.
Усі характеристики об'єктиву зазвичай вигравірувані з його оправі: власне збільшення, апертура, тип об'єктиву (АПО - апохромат тощо. п.); об'єктиви водної імерсії мають позначення ВІ та біле кільце навколо оправи в нижній її частині, об'єктиви масляної імерсії-позначення МІ та чорне кільце.
Окуляри складаються з двох лінз і теж бувають декількох типів, кожен з яких застосовується з певним типом об'єктива, додатково усуваючи недоліки зображення. Тип окуляра та його збільшення позначені з його оправі.
Конденсор призначений для того, щоб сфокусувати на препараті світло від освітлювача, яке спрямовується дзеркалом мікроскопа або освітлювача (у разі використання накладного або вбудованого освітлювача). Однією з деталей конденсора є апертурна діафрагма, яка має важливе значення для правильного висвітлення препарату.
Освітлювач складається з низьковольтної лампи розжарювання з товстою ниткою, трансформатора, колекторної лінзи та польової діафрагми, від розкриття якої залежить діаметр освітленого поля на препараті. Дзеркало спрямовує світло від освітлювача в конденсор.
Для того щоб зберегти паралельність променів, що йдуть від освітлювача в конденсор, необхідно використовувати лише плоску сторону дзеркала.
Налаштування освітлення н фокусування мікроскопа Якість зображення значною мірою залежить також від правильного освітлення. Існує кілька різних способів висвітлення препарату при мікроскопії. Найбільш поширеним є спосібустановки світла по Келеру
, який полягає в наступному:
1) встановлюють освітлювач проти дзеркала мікроскопа;
2) включають лампу освітлювача та направляють світло на плоске (!) дзеркало мікроскопа;
3) поміщають препарат на предметний столик мікроскопа;
4) закривають дзеркало мікроскопа листком білого паперу та фокусують на ньому зображення нитки лампи, пересуваючи патрон лампи в освітлювачі;
5) прибирають аркуш паперу із дзеркала;
6) закривають апертурну діафрагму конденсора. Переміщуючи дзеркало та злегка пересуваючи патрон лампи, фокусують зображення нитки на апертурній діафрагмі. Відстань освітлювача від мікроскопа повинна бути такою, щоб зображення нитки лампи дорівнювало діаметру апертурної діафрагми конденсора (спостерігати апертурну діафрагму можна за допомогою плоского дзеркала, поміщеного з правого боку основи мікроскопа).
7) відкривають апертурну діафрагму конденсора, зменшують отвір польової діафрагми освітлювача і значно зменшують напруження лампи;
9) злегка повертаючи дзеркало, переводять зображення польової діафрагми, яке має вигляд світлої плями, у центр поля зору. Опускаючи і піднімаючи конденсор, домагаються отримання різкого зображення країв польової діафрагми в площині препарату (навколо них може бути видно кольорову облямівку);
10) розкривають польову діафрагму освітлювача до країв поля зору, збільшують розжарення нитки лампи і злегка (на 1/3) зменшують розкриття апертурної діафрагми конденсора;
11) при зміні об'єктива необхідно перевірити налаштування світла.
Після закінчення налаштування світла по Келеру не можна змінювати положення конденсораf розкриття польової та апертурної діафрагми. Освітленість препарату можна регулювати лише нейтральними світлофільтрами або зміною напруження лампи за допомогою реостату.
Зайве відкриття апертурної діафрагми конденсора може призвести до значного зниження контрасту зображення, а недостатнє - значного погіршення якості зображення (появу дифракційних кілець). Для перевірки правильності розкриття апертурної діафрагми необхідно видалити окуляр і, дивлячись у тубус, відкрити її таким чином, щоб вона закривала поле, що світиться, на одну третину.
Для правильного освітлення препарату під час роботи з об'єктивами малого збільшення (до 10х) необхідно відкрутити і зняти верхню лінзу конденсора.
Увага! При роботі з об'єктивами, що дають велике збільшення - з сильними сухими (40х) та імерсійними (90х) системами, щоб не пошкодити фронтальну лінзу, при фокусуванні користуються наступним прийомом: спостерігаючи збоку, опускають об'єктив макровинтом майже до зіткнення з препаратом, потім, дивлячись окуляр макровинтом дуже повільно піднімають об'єктив до появи зображення і за допомогою мікрогвинта роблять остаточне фокусування мікроскопа.
Догляд за мікроскопом
З дзеркал, що мають зовнішнє сріблення, можна лише видаляти пил, здуваючи його гумовою грушею. Протирати їх не можна. Не можна також самостійно розгвинчувати та розбирати об'єктиви - це призведе до їх псування. Після закінчення роботи на мікроскопі необхідно ретельно видалити залишки імерсійної олії з фронтальної лінзи об'єктива вказаним вище способом. Потім опустити предметний столик (або конденсор у мікроскопах із нерухомим столиком) та накрити мікроскоп чохлом.
Для збереження зовнішнього вигляду мікроскопа необхідно періодично протирати його м'якою ганчіркою, злегка просоченою безкислотним вазеліном і сухою м'якою чистою ганчіркою.
Крім звичайної світлової мікроскопії, існують методи мікроскопії, що дозволяють вивчати незабарвлені мікроорганізми: фазово-контрастна , темнопільнаі люмінесцентнаМікроскопія. Для вивчення мікроорганізмів та їх структур, розмір яких менше роздільної здатності світлового мікроскопа використовують
Мікроскоп призначений для спостереження дрібних об'єктів з більшим збільшенням і більшою роздільною здатністю, ніж дає лупа. Оптична система мікроскопа складається з двох частин: об'єктиву та окуляра. Об'єктив мікроскопа утворює збільшене дійсне зворотне зображення предмета в передній фокальній площині окуляра. Окуляр діє як лупа і утворює уявне зображення з відривом найкращого бачення. По відношенню до всього мікроскопа предмет, що розглядається, розташовується в передній фокальній площині.
Збільшення мікроскопа
Дія мікрооб'єктиву характеризують його лінійним збільшенням: V про =-Δ/F" про * F" про - фокусна відстань мікрооб'єктива * Δ - відстань між заднім фокусом об'єктива і переднім фокусом окуляра, зване оптичним інтервалом або оптичною довжиною тубуса.
Зображення, створюване об'єктивом мікроскопа в передній фокальній площині окуляра розглядається через окуляр, який діє як лупа з видимим збільшенням:
G ок = ¼ F ок
Загальне збільшення мікроскопа визначається як добуток збільшення об'єктиву збільшення окуляра: G=V про *G ок
Якщо відома фокусна відстань всього мікроскопа, його видиме збільшення можна визначити так само, як і у лупи:
Як правило, збільшення сучасних об'єктивів мікроскопів стандартизоване та складає ряд чисел: 10, 20, 40, 60, 90, 100 крат. Збільшення окулярів теж мають цілком певні значення, наприклад, 10, 20, 30 крат. У всіх сучасних мікроскопах є комплект об'єктивів та окулярів, які спеціально розраховуються та виготовляються так, що підходять один до одного, тому їх можна комбінувати для отримання різних збільшення.
Поле зору мікроскопа
Поле зору мікроскопа залежить від кутового поля окуляра ω , В межах якого виходить зображення досить гарної якості: 2y = 500 * tg (ω) / G * G - збільшення мікроскопа
При даному кутовому полі окуляра лінійне поле мікроскопа у просторі предметів тим менше, чим більше його видиме збільшення.
Діаметр вихідної зіниці мікроскопа
Діаметр вихідної зіниці мікроскопа обчислюється так:
де A - Передня апертура мікроскопа.
Діаметр вихідної зіниці мікроскопа зазвичай трохи менший за діаметр зіниці ока (0.5 – 1 мм).
При спостереженні в мікроскоп зіницю ока потрібно поєднувати з вихідною зіницею мікроскопа.
Роздільна здатність мікроскопа
Однією з найважливіших характеристик мікроскопа є його роздільна здатність. Відповідно до дифракційної теорії Аббе, лінійна межа дозволу мікроскопа, тобто мінімальна відстань між точками предмета, які зображуються як роздільні, залежить від довжини хвилі та числової апертури мікроскопа:
Досяжну роздільну здатність оптичного мікроскопа можна порахувати, виходячи з виразу для апертури мікроскопа . Якщо врахувати, що максимально можливе значення синуса кута - одиничне, то для середньої довжини хвилі можна обчислити роздільну здатність мікроскопа: 
Підвищити роздільну здатність мікроскопа можна двома способами: * Збільшуючи апертуру об'єктива, * Зменшуючи довжину хвилі світла.
Іммерсія
Для того щоб збільшити апертуру об'єктива, простір між предметом, що розглядається, і об'єктивом заповнюється так званою іммерсійною рідиною – прозорою речовиною з показником заломлення більше одиниці. Як таку рідину використовують воду, кедрова олія, розчин гліцерину та інші речовини. Апертури імерсійних об'єктивів великого збільшення досягають величини , тоді досяжна роздільна здатність імерсійного оптичного мікроскопа складе. 
Застосування ультрафіолетових променів
Для збільшення роздільної здатності мікроскопа другим способом застосовуються ультрафіолетові промені, довжина хвилі яких менша, ніж у видимих променів. При цьому має бути використана спеціальна оптика, прозора для ультрафіолетового світла. Оскільки людське око не сприймає ультрафіолетове випромінювання, необхідно або вдатися до засобів, що перетворюють невидиме ультрафіолетове зображення на видиме, або фотографувати зображення в ультрафіолетових променях. При довжині хвилі роздільна здатність мікроскопа складе.
Крім підвищення роздільної здатності, метод спостереження в ультрафіолетовому світлі є й інші переваги. Зазвичай живі об'єкти прозорі у видимій області спектра, і тому перед спостереженням їх забарвлюють. Але деякі об'єкти (нуклеїнові кислоти, білки) мають вибіркове поглинання в ультрафіолетовій ділянці спектру, завдяки чому вони можуть бути «видимі» в ультрафіолетовому світлі без фарбування.
Роздільна здатність ока обмежена. Роздільна здатністьхарактеризується дозволеною відстанню, тобто. мінімальною відстанню між двома сусідніми частинками, за якої вони ще видимі окремо. Відстань для неозброєного ока становить близько 0,2 мм. Для збільшення роздільної здатності використовують мікроскоп. Для дослідження будови металів мікроскоп був вперше застосований в 1831 Аносовим П.П., що вивчав булатну сталь, і пізніше, в 1863 англійцем Г. Сорбі, що вивчав метеоритне залізо.
Відстань, що дозволяється визначається співвідношенням:
де l- Довжина хвилі світла, що йде від об'єкта дослідження в об'єктив, n– показник заломлення середовища, що знаходиться між об'єктом та об'єктивом, та a- кутова апертура, що дорівнює половині кута розкриття, що входить до об'єктиву пучка променів, що дають зображення. Ця важлива характеристика об'єктива вигравірувана з його оправі.
У добрих об'єктивів максимальний апертурний кут a = 70 ° і sina » 0,94. У більшості досліджень застосовують сухі об'єктиви, що працюють у повітряному середовищі (n = 1). Для зменшення дозволеної відстані використовують імерсійні об'єктиви. Простір між об'єктом та об'єктивом заповнюють прозорою рідиною (імерсією) з великим показником заломлення. Зазвичай використовують краплю кедрової олії (n = 1,51).
Якщо для видимого білого світла прийняти l = 0,55 мкм, то мінімальна роздільна здатність світлового мікроскопа:
Таким чином, роздільна здатність світлового мікроскопа обмежена довжиною хвилі світла. Об'єктив дає збільшення проміжного зображення об'єкта, що у окуляр, як у лупу. Окуляр збільшує проміжне зображення об'єкта і не може підвищити роздільну здатність мікроскопа.
Загальне збільшення мікроскопа дорівнює добутку збільшення об'єктиву та окуляра. На металографічних мікроскопах проводять дослідження структури металів зі збільшенням від 20 до 2000 разів.
Початківці роблять звичайну помилку, прагнучи розглядати структуру відразу при великому збільшенні. Слід пам'ятати, що більше збільшення об'єкта, тим менша ділянка видно у зору мікроскопа. Тому рекомендується починати дослідження з використанням слабкого об'єктиву, щоб спочатку оцінити загальний характер структури металу на великій площі. Якщо ж починати мікроаналіз з використання сильного об'єктиву, багато важливі особливості структури металу може бути непомічені.
Після загального перегляду структури при малих збільшеннях мікроскопа вибирають об'єктив з такою роздільною здатністю, щоб побачити всі необхідні найдрібніші деталі структури.
Окуляр вибирають так, щоб чітко було видно деталі структури, збільшені об'єктивом. При недостатньому збільшенні окуляра дрібні деталі проміжного зображення, створеного об'єктивом, не будуть побачені в мікроскоп, і таким чином роздільна здатність об'єктива повністю не буде використана. При занадто великому збільшенні окуляра нові деталі структури не виявляються, водночас контури вже виявлених деталей виявляться розмитими, поле зору стане вужчим. Власне збільшення окуляра вигравіруване з його оправі (наприклад, 7 х).
Технічно можливо створити оптичні мікроскопи, об'єктиви та окуляри яких дадуть загальне збільшення 1500-2000 і більше. Однак це недоцільно, оскільки можливість розрізнити дрібні деталі предмета обмежується дифракційними явищами. Внаслідок цього зображення найдрібніших деталей предмета втрачає різкість, може виникнути порушення геометричної подоби зображення та предмета, сусідні точки зливатимуться в одну, можливо повне зникнення зображення. Тому в оптиці існують такі поняття, що характеризують якість мікроскопа:
Роздільна здатність мікроскопа- властивість мікроскопа давати окремо зображення дрібних деталей предмета, що розглядається.
Межа дозволу- це найменша відстань між двома точками, які помітні в мікроскопі окремо.
Чим менше межа роздільної здатності, тим вище роздільна здатність мікроскопа!
Межа роздільної здатності обумовлює найменший розмір деталей, які можуть бути різними в препараті за допомогою мікроскопа.
Теорію роздільної здатності мікроскопа розробив директор заводу К.Цейса в Єні професор-оптик Е.Аббе (1840-1905). Як найпростіший мікропрепарат він взяв дифракційну решітку (рис. 2), вивчив механізм формування зображення в мікроскопі та показав наступне.
Введемо поняття апертурного кута- це кут між крайніми променями конічного світлового пучка, що йде від середини об'єкта в об'єктив (рис. 3, а). Для створення зображення, тобто для дозволу об'єкта, достатньо, щоб до об'єктиву потрапили промені, що утворюють максимуми тільки нульового і першого порядку хоча б з одного боку (мал. 2 і 3, б). Участь освіти зображення променів від більшої кількості максимумів підвищує якість зображення, його контраст. Тому промені, що утворюють ці максимуми, мають бути в межах апертурного кута об'єктива.
 |
а Б В Г)
1 - фронтальна лінза об'єктива, 2 - об'єктив
Таким чином, якщо об'єктом є дифракційна решітка з періодом dі світло падає на неї нормально (рис.2 та 3, б), то у формуванні зображення обов'язково повинні брати участь промені, що утворюють максимуми нульового та першого порядків з обох сторін, а кут j 1 - кут відхилення променів, що утворюють максимум першого порядку, відповідно повинен бути, у крайньому випадку, дорівнює куту U/2.
Якщо ж взяти ґрати з меншим періодом d', то кут j' 1 буде більшим за кут U/2 та зображення не виникне. Значить період решітки dможна прийняти за межу дозволу мікроскопа Z. Тоді, використовуючи формулу дифракційної решітки, запишемо для k=1:
Замінюючи dна Z, а j 1 на U/2, отримаємо
. (6)
Під час мікроскопії світлові промені падають на об'єкт під різними кутами. При похилому падінні променів (рис.3, г) межа дозволу зменшується, так як у формуванні зображення братимуть участь тільки промені, що утворюють максимуми нульового порядку і першого порядку з одного боку, а кут j 1 дорівнюватиме апертурному куту U. Розрахунки показують, що формула межі дозволу у разі приймає такий вид:
. (7)
Якщо простір між об'єктом та об'єктивом заповнити імерсійним середовищем з показником заломлення n, який більший за показник заломлення повітря, то довжина хвилі світла l n= l ¤ n. Підставляючи цей вираз у формулу для межі дозволу (7), отримаємо
, або 
. (8)
Таким чином, формула (7) визначає межу дозволу для мікроскопа із сухим об'єктивом, а формула (8) -для мікроскопа з імерсійним об'єктивом. Величини sin 0,5 Uкорисне n× sin0,5 Uу цих формулах називають числовою апертурою об'єктива і позначають буквою А. З огляду на це формулу межі дозволу мікроскопа в загальному вигляді записують так:
Як видно з формул (8) і (9), роздільна здатність мікроскопа залежить від довжини хвилі світла, величини апертурного кута, показника заломлення середовища між об'єктивом і об'єктом, кута падіння світлових променів на об'єкт, але вона не залежить від параметрів окуляра. Окуляр ніякої додаткової інформації про структуру об'єкта не дає, якість зображення не підвищує, він лише збільшує проміжне зображення.
Роздільна здатність мікроскопа може бути підвищена за рахунок використання імерсії та зменшення довжини хвилі світла. Підвищення роздільної здатності під час використання імерсії можна пояснити так. Якщо між об'єктивом і об'єктом знаходиться повітря (сухий об'єктив), то світловий промінь при переході з покривного скла в повітря середовище з меншим показником заломлення значно змінює свій напрямок в результаті заломлення, тому менше променів потрапляє в об'єктив. При використанні імерсійного середовища, показник заломлення якого приблизно дорівнює показнику заломлення скла, зміна ходу променів у середовищі не спостерігається і більше променів потрапляє в об'єктив.
Як імерсійну рідину беруть воду ( n=1,33), кедрова олія ( n=1,515) та ін. Якщо максимальний апертурний кут у сучасних об'єктивів досягає 140 0 то для сухого об'єктиву А=0,94, а об'єктиву з масляною імерсією А=1,43. Якщо при розрахунку використовувати довжину хвилі світла l = 555 нм, до якої найбільш чутливе око, то межа роздільної здатності сухого об'єктива становитиме 0,30 мкм, а з масляною імерсією - 0,19 мкм. Значення числової апертури вказується на оправі об'єктива: 0,20; 0,40; 0,65 та ін.
Підвищення роздільної здатності оптичного мікроскопа за рахунок зменшення довжини хвилі світла досягається при використанні ультрафіолетового випромінювання. Для цього є спеціальні ультрафіолетові мікроскопи з кварцовою оптикою та пристроями для спостереження та фотографування об'єктів. Так як у цих мікроскопах використовується світло з довжиною хвилі приблизно вдвічі менше, ніж у видимого світла, то вони здатні дозволяти структури препарату розмірами близько 0,1 мкм. Ультрафіолетова мікроскопія має ще одну перевагу – з її допомогою можна досліджувати незабарвлені препарати. Більшість біологічних об'єктів прозорі у видимому світлі, оскільки не поглинають його. Однак вони мають вибіркове поглинання в ультрафіолетовій області і, отже, легко помітні в ультрафіолетових променях.
Найбільша роздільна здатність у електронного мікроскопа, так як довжина хвилі при русі електрона в 1000 разів менше довжини світлової хвилі.
Корисне збільшення мікроскопа обмежено його роздільною здатністю і роздільною здатністю ока.
Роздільна здатність ока характеризується найменшим кутом зору, у якому людське око ще розрізняє окремо дві точки предмета. Вона лімітується дифракцією на зіниці та відстанню між світлочутливими клітинами сітківки. Для нормального ока найменший кут зору дорівнює 1 хвилині. Якщо предмет знаходиться на відстані найкращого зору - 25 см, цей кут відповідає предмету розміром 70 мкм. Цю величину вважають межею дозволу неозброєного ока Z rна відстані найкращого зору. Однак показано, що оптимальна величина Z rдорівнює 140-280 мкм. При цьому очі відчуває найменшу напругу.
Корисним збільшенням мікроскопаназивають його максимальне збільшення, у якому око ще може розрізняти деталі, рівні за величиною межі дозволу мікроскопа.
Лінійне збільшення мікроскопа дорівнює відношенню величини зображення предмета, розташованого з відривом найкращого зору, до величини самого предмета (див. формулу 1). Якщо розмір предмета приймемо межу дозволу мікроскопа Z, а розмір зображення - межа дозволу неозброєного ока з відривом найкращого зору Z r, то отримаємо формулу корисного збільшення мікроскопа:
Підставляючи у цю формулу Zз виразу (9), отримаємо
. (11)
Підставивши у формулу (11) довжину хвилі світла 555 нм (555×10 -9 м), оптимальні величини меж роздільної здатності ока 140-280 мкм (140-280×10 -6 м), знайдемо інтервал значень корисного збільшення мікроскопа
500 А < Доп< 1000 А .
Наприклад, при використанні кращих імерсійних об'єктивів з числовою апертурою 1,43, корисне збільшення становитиме 700-1400, звідси видно, що конструювати оптичні мікроскопи з великим збільшенням недоцільно. Однак на даний час це питання втратило свою гостроту у зв'язку з широким використанням у біології та медицині електронного мікроскопа, що забезпечує збільшення до 600 000, а межа дозволу – до 0,1 нм.
