Cartografierea genelor, metode și implicații. Cartografierea genomului Cartografierea cognitivă și codificarea operațională

După o scurtă trecere în revistă a principalelor metode utilizate cel mai des în genetica moleculară pentru a studia structura și mecanismele funcționării genelor, pare oportună, folosind exemplul genomului uman, să aruncăm o privire mai atentă asupra aplicării practice a acestor metode și a acestora. modificări pentru studiul genomilor mari. Pentru a studia cuprinzător genomul uman, acest depozit colosal de informații genetice, a fost dezvoltat recent și este în curs de implementare un program internațional special „Proiectul genomului uman”. Scopul principal al programului este de a construi hărți genetice cuprinzătoare, de înaltă rezoluție, ale fiecăruia dintre cei 24 de cromozomi umani, care ar trebui să culmineze în cele din urmă cu determinarea structurii complete a ADN-ului primar a acestor cromozomi. În prezent, lucrările la proiect sunt în plină desfășurare. Dacă este finalizat cu succes (și acest lucru este planificat să se întâmple în 2003), omenirea va avea perspective pentru un studiu amănunțit al semnificației funcționale și mecanismelor de funcționare a fiecăreia dintre genele sale, precum și mecanismele genetice care controlează biologia umană și pentru a stabili cauzele majorității stărilor patologice ale organismului său .

1. Abordări de bază pentru cartografierea genomului uman

Rezolvarea sarcinii principale a programului Genom uman include trei etape principale. În prima etapă, este necesar să se împartă în mod specific fiecare cromozom individual în părți mai mici, permițând analiza lor ulterioară folosind metode cunoscute. A doua etapă a cercetării implică determinarea poziției relative a acestor fragmente individuale de ADN unul față de celălalt și localizarea lor în cromozomii înșiși. În etapa finală, este necesar să se determine efectiv structura ADN-ului primar a fiecărui fragment de cromozom caracterizat și să se compila o secvență continuă completă a nucleotidelor lor. Soluția problemei nu va fi completă dacă nu este posibilă localizarea tuturor genelor organismului în secvențele de nucleotide găsite și determinarea semnificației lor funcționale. Trecerea celor trei etape de mai sus este necesară nu numai pentru a obține caracteristici cuprinzătoare ale genomului uman, ci și ale oricărui alt genom mare.

1. Hărți de legătură genetică

Hărți de legătură genetică reprezintă diagrame unidimensionale ale poziţiei relative markeri genetici pe cromozomi individuali. Markerii genetici sunt înțeleși ca orice caracteristică fenotipică ereditară care diferă între indivizi. Trăsăturile fenotipice care îndeplinesc cerințele markerilor genetici sunt foarte diverse. Acestea includ atât caracteristici comportamentale sau predispoziție la anumite boli, cât și caracteristici morfologice ale organismelor întregi sau ale macromoleculelor lor care diferă ca structură. Odată cu dezvoltarea unor metode simple și eficiente pentru studiul macromoleculelor biologice, astfel de caracteristici, cunoscute sub numele markeri moleculari, au devenit cel mai des folosite în construirea hărților de legături genetice. Înainte de a trece la luarea în considerare a metodelor de construire a unor astfel de hărți și a semnificației acestora pentru cercetarea genomului, este necesar să ne amintim că termenul " ambreiaj„ este folosit în genetică pentru a indica probabilitatea transmiterii comune a două trăsături de la un părinte la descendent.

Când celulele sexuale (gameții) se formează la animale și plante în stadiul de meioză, de obicei are loc sinapsa (conjugarea) cromozomilor omologi. Cromatidele surori ale cromozomilor omologi sunt conectate pe toată lungimea între ele și, ca rezultat trecere peste(recombinare genetică între cromatide) părțile lor sunt schimbate. Cu cât doi markeri genetici sunt localizați mai departe unul de celălalt pe cromatidă, cu atât este mai probabil ca între ei să se producă ruptura cromatidă necesară încrucișării, iar cei doi markeri de pe noul cromozom aparținând noului gamet să fie separați de fiecare. altele, adică li se va rupe aderenta. Unitatea de legătură a markerilor genetici este Morganida(unitatea Morgan, M), care conține 100 centimorganid(cm). 1 cM corespunde distanței fizice de pe harta genetică dintre doi markeri, recombinarea între care are loc la o frecvență de 1%. Exprimat în perechi de baze, 1 cM corespunde la 1 milion bp. (m.b.o.) ADN.

Hărțile de legătură genetică reflectă corect ordinea markerilor genetici de pe cromozomi, dar distanțele rezultate dintre ei nu corespund distanțelor fizice reale. Acest fapt este de obicei asociat cu faptul că eficiența recombinării între cromatide pe secțiuni individuale de cromozom poate varia foarte mult. În special, este suprimată în regiunile heterocromatice ale cromozomilor. Pe de altă parte, punctele fierbinți de recombinare apar adesea în cromozomi. Utilizarea frecvențelor de recombinare pentru a construi hărți genetice fizice fără a lua în considerare acești factori va duce la distorsiuni (subestimare sau supraestimare, respectiv) a distanțelor reale dintre markerii genetici. Astfel, hărțile de legătură genetică sunt cele mai puțin precise dintre toate tipurile de hărți genetice disponibile și pot fi considerate doar ca o primă aproximare a hărților fizice reale. Cu toate acestea, în practică, ei și numai ei fac posibilă localizarea markerilor genetici complexi (de exemplu, cei asociați cu simptomele unei boli) în primele etape ale studiului și fac posibilă studierea lor în continuare. Trebuie amintit că, în absența încrucișării, toate genele situate pe un cromozom individual ar fi transmise de la părinți la urmași împreună, deoarece sunt legate fizic între ele. Prin urmare, se formează cromozomi individuali grupuri de legături genice,și una dintre primele sarcini în construirea hărților de legătură genetică este de a atribui gena sau secvența de nucleotide aflată în studiu unui grup de legătură specific. În tabel II.4 enumeră metode moderne, care, potrivit V.A. McKusick a fost cel mai adesea folosit pentru a construi hărți de legături genetice până la sfârșitul anului 1990.

Cartografierea este cel mai simplu mod de a andocare contigs.

Cartografierea genomului poate fi genetică sau fizică.

Harta genetica:

Conține o genă - un marker fenotipic;

Markeri moleculari:

RFLP (restriction fragment length polymorphism) este o metodă pentru studierea ADN-ului genomic prin tăierea ADN-ului folosind endonucleaze de restricție (clivare acizi nucleici la mijloc) și analiza suplimentară a fragmentelor rezultate (restricții) prin electroforeză pe gel;

SSLP (simple repeat length polymorphism) - Există 2 tipuri: minisateliți și microsateliți. Microsateliți– repetați 2,3,4 n.p. Acestea sunt erori în funcționarea ADN polimerazei. Când există un loc în care oligonucleotida se repetă de multe ori, există posibilitatea ca ADN polimeraza alunecării. Cu un anumit grad de probabilitate, se poate disocia de matrice și se poate alătura repetiției vecine. Ca rezultat, replicarea va avea fie una mai mult, fie una mai puțin;

SNP ( Polimorfism cu o singură nucleotidă) – diferențe de secvență ADN a 1 nucleotidă în genomul unui reprezentant al aceleiași specii;

Detectarea markerilor moleculari:

1. Hibridarea ADN-ului:

1.1. Sondele se vor împerechea cu ADN monocatenar, producând complemente complete sau incomplete.

1.2. Electroforeza în PAA. Transferați cu hârtie de nitroceluloză. Sondele radiomarcate hibridizează cu ADN. Detectat autoradiografic.

Folosit pentru detectarea markerilor moleculari:

1. Locuri repetate;

2. Polimorfismul fragmentului de restricție (RFLP, RFLP) – procesarea enzimelor de restricție.

Tipuri de repetare:

1. Polimorfism scurt (2-4 nt) de lungime a secvenței simple (SSLP);

2. Minisateliți (până la 25 de nucleotide) VNTR;

3. Microsateliți (di- sau tetranucleotide) STR, SSR;

Polimorfism cu un singur nucleotidă în gel de agaroză (SNP);

(AGTCA G AAATC);

(AGTCA C AAATC);

Folosirea cipurilor ADN folosind fotolitoautografia.

Substratul de sticlă este prelucrat și i se aplică o nucleotidă. Capătul 5’ este blocat, iar iluminarea cu laser îndepărtează fragmentul de blocare. Sute de mii de sonde pot fi aplicate astfel.

Fragmentele care nu se hibridizează sunt spălate; determinate de pete (din ADN marcat fluorescent).

Defecte:

1. Rezoluție limitată (maximum 1 genă la 3,3 kb la E. coli și 1 genă la 10 kb la S. cerevisiae);

2. Rezoluție limitată din cauza trecerii neuniforme.

Metode de bază de cartografiere fizică:

1. Maparea restricțiilor;

2. FiSH (hibridare fluorescentă in situ);

3. cartografiere STS;

Maparea restricțiilor este determinarea locațiilor relative și a locurilor de restricție specifice pe o hartă genomică și a distanțelor dintre ele.

Caracteristicile parcelelor mari:

1. Utilizarea enzimelor de restricție care recunosc 7-8 nucleotide;

2. Utilizarea enzimelor de restricție, al căror loc de recunoaștere include combinații rare de nucleotide;

3. Utilizarea tehnicilor speciale de electroforeză pe gel cu un câmp electric alternativ pentru a separa fragmente mari de ADN.

Abordarea clasică este electroforeza pentru a determina dimensiunea fragmentelor. Sunt necesare cel puțin 2 enzime de restricție, fiecare dintre ele prelucrează fragmentul de ADN studiat.

Primul lucru pe care trebuie să-l faci este să alegi o enzimă de restricție care se taie mai rar, astfel încât să obții un număr rezonabil de fragmente. Iată frecvențele site-ului calculate statistic pentru diferite endonucleaze cu diferite dimensiuni ale situsului. Se iau enzimele de restricție care au cel mai lung situs, plus enzimele de restricție care au combinații rare de nucleotide sunt selectate special la situsuri. În acest fel obținem o reacție de restricție cu un număr rezonabil de fragmente, dar trebuie totuși să determinăm dimensiunea acestor fragmente. Pentru a determina dimensiunea fragmentelor mari se folosesc tehnici speciale: fie electroforeza în câmp alternant, fie alte metode de vizualizare care sunt combinate sub denumirea de cartografiere optică. .

În primul rând, în acest fel puteți găsi enzime care se vor tăia și mai rar. În special, folosind exemplul genomului uman, acest site arată de ce avem puține combinații de CG. În genomul uman, literele CG situate una lângă alta se găsesc numai în regiunile promotoare. Prin urmare, ele nu sunt prezente în cea mai mare parte a genomului. De ce se întâmplă asta? Deoarece citozina este metilată, adică. se adaugă o grupare metil. Era citozină, s-a dovedit a fi 5-metilcitozină. Orice grupare amino din compoziția bazelor azotate este capabilă de hidroliză cu o probabilitate destul de mare. Reziduul din hidroliză este înlocuirea grupării amino cu o grupare oxo, iar dacă citozina este înlocuită, atunci obținem uracil, care este o bază uniformă și, în consecință, este tăiată de sistemul de reparare, dar dacă este 5- metilcitozină, apoi obținem timină, iar aceasta este o bază legală în ADN. În consecință, dacă litera C nu este critică în locul corespunzător al secvenței genomice, atunci presiunea evolutivă este destul de severă - înlocuind litera C cu litera T. Presiunea evolutivă va fi mai mare în secvența codificatoare și în secvența promotorului , deoarece secvențele CG metilate sunt un semnal de reglementare important care controlează. Acestea sunt așa-numitele drepturi CPGS, acolo unde acestea există aproape sigur va exista o zonă de reglementare care este activată. Astfel, dacă sarcina este de a selecta enzime de restricție rare, atunci va fi necesară selectarea enzimelor de restricție al căror situs include aceste combinații de nucleotide. Să vedem ce se întâmplă .

O opțiune este electroforeza într-un câmp pulsatoriu. Electroforeza standard este foarte prost potrivită pentru fragmente cu mai mult de 50 mii bp. Toate se adună într-o grămadă în partea de sus a gelului, nu se separă, iar unele dintre ele chiar rămân în gaură. Pentru a le separa, condițiile electroforezei se schimbă - doi electrozi sunt modificați la 4 și se aplică mai întâi o tensiune alternativă unui electrod, apoi celuilalt. Când se aplică tensiune primului electrod, fragmentul de ADN se mișcă pe o distanță foarte scurtă și se blochează în porii agarozei. Tensiunea se schimbă, curentul este furnizat altor electrozi, fragmentul de ADN este scos din acele celule în care este blocat și se mișcă puțin, apoi direcția se schimbă din nou. Mișcarea se dovedește a fi în zig-zag. Dar pașii sunt foarte scurti și se adaugă la o mișcare liniară. De fapt, rezultatul este electroforeza obișnuită, diferența este că fragmentele mari vor fi clar separate, deoarece mobilitatea este complet diferită. Nu atât de rigid legat de masa fragmentelor. Electroforeza are un mare dezavantaj - nu este o măsurare directă a dimensiunii ADN-ului. Un marker molecular va rula de-a lungul uneia dintre piste și se va compara lungimea cursei - un indicator indirect.

Ceea ce se numește cartografiere optică este un înlocuitor pentru electroforeza, aici dimensiunea fragmentelor este măsurată direct. Esența sa constă în faptul că ADN-ul se îndreaptă într-unul din mai multe moduri, este scos dintr-o minge răsucită. Mai mult, se întinde sub tensiune. Mai mult, tensiunea moleculei de ADN este procesată de o enzimă de restricție, după tăiere, capetele moleculei se depărtează de locul tăiat; Apoi, un astfel de preparat este examinat la microscop, ADN-ul este colorat cu un colorant fluorescent intercalat și locurile de rupere sunt vizibile. Măsurarea directă a lungimii la microscop. Două opțiuni pentru obținerea ADN-ului liniar încordat: în ambele cazuri, se utilizează proprietatea graniței dintre diferite faze. Când ADN-ul trece printr-o interfață de fază, este alungit. Prima tehnică folosește ADN într-o soluție de agaroză topită. ADN-ul este aplicat pe o lamă de sticlă, iar după un timp agaroza începe să se întărească. Întărirea nu are loc niciodată uniform, începe întotdeauna într-un loc. Frontul de cristalizare a agarozei se deplasează din punctul inițial și se răspândește. Când trece printr-o moleculă de ADN, trage această moleculă împreună cu ea și, ca rezultat, obținem o moleculă aliniată într-o stare tensionată. Apoi se adaugă aici o enzimă, în unele cazuri enzima este imediat imobilizată pe sticlă, apoi se adaugă ioni de magneziu împreună cu tamponul corespunzător, sau poate invers - apoi enzima. Dar prima opțiune este mai bună - difuzează mai bine. O altă metodă se bazează pe faptul că lamela este îndepărtată foarte lent din soluția de ADN. Se tratează cu o soluție de silan, care crește sorbția ADN-ului, unele dintre molecule sunt absorbite pe această bucată de sticlă și se scoate foarte încet, câțiva milimetri pe oră, din soluție și când trece prin film de tensiune superficială, moleculele de ADN sunt trase în jos din locul în care sunt fixate. Direcția este opusă mișcării sticlei. Obținem o moleculă aliniată în stare stresată, apoi sticla este tratată cu o enzimă de restricție.

În starea nepereche, nu există hibridizare. Detectarea SNP-urilor prin hibridizarea soluției. În timpul hibridizării, ac de păr se deschide.

Următoarea tehnică de cartografiere este hibridizarea prin fluorescență pe preparate - FISH .

Aici se vizualizează direct un locus, în conformitate cu poziția sondei fluorescente pe cromozomii colorați cu un colorant citologic (cromozomi răsuciți). Medicamentul este aplicat pe sticlă, fixat pe acesta și supus denaturarii parțiale. Ca rezultat, obținem secțiuni de-a lungul lungimii cromozomului într-o stare monocatenară. Se adaugă o probă care hibridizează cu aceste zone, iar apoi un astfel de dispozitiv este colorat cu coloranți corespunzători și microscopat. Microscopia se efectuează în domeniul vizibil, microscopia fluorescentă. Proba este iradiată cu un laser la o anumită lungime de undă și se observă fluorescență. Ca rezultat, obținem un model de fluorescență suprapus modelului de bandă caracteristic unui cromozom dat. Am făcut o sondă pentru o anumită genă și am văzut imediat unde se află această genă pe cromozom.

Dezavantaje: rezoluția este destul de mică, nu mai mult de 1 milion n. între zonele adiacente. Modificările tehnicilor sunt utilizate pentru a crește rezoluția.

Cel mai simplu de fapt nu schimbă nimic - întinderea mecanică a cromozomilor. Preparatul de cromozomi este centrifugat într-o centrifugă la viteză mică. Cromozomii sunt alungiți sub influența forțelor centrifuge, principalul lucru este să nu exagerați cu revoluțiile. Proteinele nu se combină și rămân în pozițiile în care sunt fixate și pot fi colorate. Rezoluția crește cu 4-5. Până la 200 mii b.p. între marcajele adiacente. Dacă este nevoie de o rezoluție mai mare, se folosesc alte modificări - cromozomi non-metafazici (rezoluție de până la 20-25 mii bp) și fibre-FISH, aceiași cromozomi, doar care sunt întinși suplimentar - întindere într-un gel, „pieptănare” moleculară. rezoluție până la 10 mii n. n. Dezavantajul acestor două metode este că nu putem lega sonda fluorescentă de harta citologică. Putem poziționa doar cele 2 sonde una față de alta și putem determina distanța dintre sonde. Trebuie să existe o sondă a cărei poziție este cunoscută și trebuie să vedem simultan atât această sondă, cât și sonda care ne interesează.

O altă metodă de cartografiere este maparea STS. . Este oarecum similar cu cartografierea genetică, dar în loc să folosească recombinarea, folosește un mod diferit de a determina distanța relativă. Criteriul aici este frecvența fragmentării ADN-ului în timpul construcției bibliotecilor și fragmentelor genomice. De fapt, esența este aceeași: molecula de ADN se rupe sub influența ultrasunetelor scăzute sau sub acțiunea enzimelor de restricție. diferența este și în ceea ce servește drept markeri. Markerii STS sunt fragmente de ADN cunoscute care apar o dată în genom și secvența trebuie cunoscută.

Când o astfel de secvență este cunoscută, o pereche de primeri poate fi selectată în cadrul acestor 100-500 nt. etc și obțineți un fragment PCR prin care este detectat de obicei un astfel de marker. Cel mai simplu mod de a selecta secvențele pentru a obține acești markeri este de a folosi secvențe EST - bucăți scurte de ADNc făcute din ARN mesager. Deoarece este o copie a ARNm, este garantat să apară o dată în genom, deoarece majoritatea genelor sunt unice. În consecință, aceasta este o secvență inițial unică. Alți markeri, mai puțin comozi, sunt markeri polimorfi în secvențe simple - minisateliți sau microsateliți. Puteți folosi și secvențe genomice aleatoare, dar sunt mai dificile deoarece este necesar să se demonstreze clar că sunt secvenţe genomice unice. Pentru a determina poziția unor astfel de markeri, este necesară o altă componentă - un reactiv de cartografiere. Acesta este doar un set de fragmente de ADN dintr-o anumită bibliotecă. Cu cât markerii sunt mai aproape unul de celălalt pe harta cromozomală reală, cu atât este mai mare probabilitatea ca aceștia să ajungă în același fragment de ADN.

Markerii sunt strâns legați și localizați în apropiere, astfel încât ajung într-un număr mare de fragmente. Markerii situati mai departe cad cel mai adesea pe diferite fragmente de ADN Dacă markerii sunt și mai departe, distanța dintre ei va depăși dimensiunea fragmentelor de bibliotecă și nu vor fi detectați deloc împreună. Toate acestea sunt culese statistic - pe baza frecvenței de apariție concomitentă a acestor markeri în bibliotecă, este posibil să se determine destul de precis distanța dintre ei pe harta cromozomală reală. Cu condiția ca fragmentarea să fie doar aleatorie. Surse de fragmente: bibliotecă de clone standard, set de celule hibride cu radiații.

Celulele hibride cu radiații sunt cele mai convenabile pentru cartografierea STS. Aceasta este o tehnologie veche, de fapt o variantă a clonării in vivo a ADN-ului eucariotic. Vorbim despre hibridizarea celulelor iradiate cu celule neiradiate. Mai mult, celulele neiradiate, de regulă, sunt celule de hamster chinezesc, iar celulele iradiate sunt celule ale oricărui mamifer, inclusiv. persoană. Dacă presupunem că acestea sunt celule umane, acestea sunt expuse la doze foarte mari de radiații γ și o astfel de celulă devine neviabilă, obținem o celulă cu ADN grav fragmentat și este imposibil să reparați astfel de cromozomi. Dacă o astfel de celulă este fuzionată cu o celulă a unui alt mamifer, atunci sistemul de reparare al celulei intacte va încerca să repare aceste rupturi dublu-catenar și rezultatul va fi incluziuni aleatorii ale fragmentelor acestui ADN în diferite părți ale cromozomilor săi intacți. Ceea ce nu a putut fi pornit în timpul diviziunii celulare va fi eliminat, iar ceea ce este pornit va fi moștenit ca standard în această linie celulară. Deoarece în fiecare cromozom sunt incluse mai multe fragmente de ADN străin, cu doza corectă de radiație, aproximativ 100 de celule de o sută de linii de astfel de hibridoame sunt suficiente pentru a construi o hartă STS detaliată a genomului eucariotic.

Folosind PCR, se înregistrează prezența markerilor într-o probă de ADN și se calculează frecvența acestor markeri în toate variantele de linii. Există diverse mecanisme de automatizare.

Esența sa se rezumă la faptul că pentru detectare nu se folosește electroforeza, ci o etichetă fluorescentă, iar această etichetă este inclusă aici într-un mod destul de inteligent. Nucleotidele fluorescente sunt adăugate la reacție, dar sistemul de detectare este capabil să detecteze doar un semnal polarizat inițial semnalul nu este polarizat - nu are loc nicio detectare; Situația începe atunci când o astfel de nucleotidă este inclusă în ADN. Aceste nucleotide sunt terminatoare, așa că sunt pornite o singură dată și fluoresc ușor diferit odată pornite. se face PCR dacă produsul este prezent, se adaugă un alt primer intern; se hibridizează cu unul dintre lanțurile de produse și i se adaugă această nucleotidă. După aceasta, semnalul devine polarizat și poate fi detectat. Dacă nu există niciun produs, nu va exista niciun semnal. Cu această modificare a detectării PCR, este posibil să se construiască rapid o hartă fizică a genomului la scara genomului eucariotic.

Când am început să vorbim despre maparea sts, am spus că a doua opțiune pentru sursa fragmentelor pentru mapare este doar o bibliotecă clonă standard. Este puțin mai puțin convenabil în sensul că trebuie folosite mult mai multe clone, frecvența de co-apariție pe un fragment este mai mică, dar screening-ul este mai extins. Dar există avantaje care compensează cel puțin parțial acest dezavantaj, sunt că aceleași clone pot fi folosite pentru a construi harta și aceleași clone pot fi apoi luate pentru secvențiere. Aceeași bibliotecă de clone poate fi utilizată pentru cartografiere și apoi pentru determinarea secvenței de nucleotide, deci nu este nevoie să se proiecteze ceva special, iar biblioteca de clone deja existentă poate fi utilizată pentru o astfel de cartografiere.

Ei bine, poate vi s-a spus când a existat citologie, despre principiul sortării celulelor asistate prin fluorescență, adică aceste celule sunt colorate cu un colorant fluorescent, adică o modificare foarte ușoară a acestei tehnici vă permite să deschideți nu celule, dar cromozomii. Și acest principiu, în consecință, face posibilă împărțirea întregului set de cromozomi în cromozomi separați, iar apoi bibliotecile sunt făcute din ADN-ul unui cromozom. Acesta este un ajutor extraordinar pentru că una este să lucrezi la o scară a genomului de 3 miliarde de perechi de nucleotide, alta la scara unui cromozom, apoi obținem o medie de 150 de milioane. Simți cum scade scara și, în mod natural, asta se foloseste metoda. Sper să vă amintiți bine acest lucru, totul aici este extrem de simplu. Ceea ce trebuie sortat este colorat cu un colorant fluorescent, în acest caz cromozomi. Cantitatea de colorant care se leagă de un cromozom depinde de mai mulți factori, în primul rând, dimensiunea cromozomului - acesta este factorul principal și, în al doilea rând, structura proteinelor care sunt asociate cu acest cromozom. Proteinele diferă ușor, diferă în primul rând în cantitatea de heterocromatină, ei bine, acest lucru determină că nu există o corelație directă între dimensiunea cromozomului și intensitatea colorării. Ei bine, ce se întâmplă în continuare, apoi soluția picura din eprubetă în picături mici, fiecare concentrație este selectată în așa fel încât picătura fie să fie goală, fie să conțină un cromozom, în niciun caz doi. Apoi, picătura este iluminată din lateral de un fascicul laser, iar dacă un cromozom este prezent în picătură, fluorescența este excitată, iar fluorescența este detectată de un detector. Intensitatea fluorescenței este proporțională cu cantitatea de colorant care s-a legat. Această cantitate caracterizează fiecare cromozom într-un mod unic în această etapă putem spune ce cromozom se află în această picătură; Apoi această pereche de electrozi, în conformitate cu intensitatea fluorescenței, încarcă picătura astfel încât să se obțină un câmp electric destul de puternic. Cu cât fluorescența este mai mare, cu atât mai multă sarcină este transmisă picăturii. Picătura zboară mai departe, trecând prin următoarea pereche de electrozi. Acești electrozi deviază picătura la dreapta sau la stânga în funcție de încărcare. Cu cât sarcina este mai mare, cu atât este mai mare deviația într-o direcție, în general, se va abate într-o direcție și, în consecință, fiecare cromozom va picura în propria eprubetă. Selectarea corectă a colorantului în cazul cromozomilor umani face posibilă separarea tuturor cromozomilor, cu excepția unei perechi, în eprubete separate. Pentru perechea de cromozomi rămasă, se ia un alt colorant, care se leagă ușor diferit și această pereche poate fi, de asemenea, separată. Astfel, obținem preparate de cromozomi individuali dintr-un preparat total de ADN, ceea ce simplifică semnificativ munca ulterioară. Aici terminăm cu cartografierea și bibliotecile.

Cartografierea genetică este încă folosită și va continua să fie folosită deoarece... Pe lângă compilarea hărților genomului, are o aplicație importantă - există o tehnică de selecție asistată de markeri care vă permite să introduceți foarte rapid gena dorită.

Genotipul unui astfel de soi nou din sălbăticie controlează în mod clar prezența acestei gene printr-un marker molecular. Dezavantajul este precizia limitată. Pentru E. coli și drojdie, cartografierea genetică se desfășoară încă din anii 50 și au fost cartografiate o mie de gene. În cazul E.coli și drojdiei, densitatea maximă a unor astfel de hărți este de o genă la 3 mii bp. în E. coli și o genă la 10 mii bp. în drojdie. În ambele cazuri se dovedește că este posibil să se cartografieze numai fiecare treime, fiecare a patra genă. Nu se poate obține o precizie mai mare. A doua problemă este legată de faptul că încrucișarea are loc neuniform pe lungimea cromozomului, există puncte fierbinți de crossing over, există secțiuni ale cromozomului care blochează crossing over - aceasta introduce o eroare suplimentară și, în plus, poate modifica pozițiile unor loci pe harta genetică. De asemenea, din cauza neatenției, numărul erorilor experimentale crește.

Cartografierea are 2 sarcini - determina locația relativă a anumitor regiuni de pe un cromozom, iar a doua sarcină este determina distanta dintre ele. Acestea. În ceea ce privește locația relativă, cartografierea genelor face față mai mult sau mai puțin la acest lucru, dacă te uiți la slide, pozițiile acestor markeri coincid, cu excepția a doi dintre ei sunt schimbate, evident că există un fel de anomalie aici; Cât despre distanța dintre marcaje, aici totul este ceva mai rău - vezi că unele distanțe se dovedesc a fi ceva mai mari, altele mai mici decât distanțele reale. În consecință, tehnicile de cartografiere fizică devin acum din ce în ce mai importante, care sunt acum parte integrantă a proiectului genomic atât în ​​abordarea clasică a secvențierii, cât și în abordarea cu pușcă, deoarece, în majoritatea cazurilor, pentru a elimina golurile la etapa de finisare, încă nu se poate lipsi de o hartă, în special pentru genomurile eucariote.

Hărți genetice ale cromozomilor- aceasta este o diagramă a poziției relative și a distanțelor relative dintre genele anumitor cromozomi situati în același grup de legătură.

Pentru prima dată în 1913 - 1915, T. Morgan și colegii săi au subliniat posibilitatea de a construi hărți genetice ale cromozomilor. Ei au arătat experimental că, pe baza fenomenelor de legare și încrucișare a genelor, este posibil să se construiască hărți genetice ale cromozomilor. Capacitatea de a mapa se bazează pe consistența procentului de încrucișare între anumite gene. Hărți genetice ale cromozomilor au fost întocmite pentru multe tipuri de organisme: insecte (drosophila, țânțar, gândaci etc.), ciuperci (drojdie, aspergillus), bacterii și viruși.

Hărțile genetice umane sunt folosite în medicină pentru a diagnostica o serie de boli ereditare grave ale omului. Studiile procesului evolutiv compară hărțile genetice ale diferitelor specii de organisme vii. Pe lângă cele genetice, există și alte hărți cromozomiale.

O hartă fizică este o reprezentare grafică a ordinii markerilor fizici (fragmente ale unei molecule de ADN), distanța dintre care este determinată în perechi de nucleotide.

O hartă de restricție este un tip de hartă fizică care indică ordinea secvenței și distanțele dintre situsurile de clivaj ADN de către enzimele de restricție (de obicei, locul de recunoaștere a enzimei de restricție este de 4-6 pb). Markerii acestei hărți sunt fragmente de restricție/site-uri de restricție.

Hartizarea cromozomilor - Determinarea poziției unei anumite gene pe un cromozom în raport cu alte gene. Sunt utilizate trei grupe principale de metode de cartografiere a genelor - fizice (determinare folosind hărți de restricție, microscopie electronică și unele variante de electroforeză a distanțelor intergenice - în nucleotide), genetice (determinarea frecvențelor de recombinare între gene, în special, în analiza familiei etc. ) și citogenetice (hibridarea in situ, producerea de hibrizi de celule monocromozomiale, metoda deleției etc.). În genetica umană, sunt acceptate 4 grade de fiabilitate a localizării unei anumite gene - confirmate (stabilite în două sau mai multe laboratoare independente sau pe materialul a două sau mai multe obiecte de testare independente), preliminar (1 laborator sau 1 familie analizată), contradictoriu (discrepanță între datele de la diferiți cercetători), îndoielnic (date nespecificate definitiv de la un laborator).

Până în prezent, nu există o clasificare clară a metodelor de cartografiere. De exemplu, unii autori clasifică metodele citogenetice (FISH, PRINS etc.) drept metode genetice, alții ca fiind fizice. Cu toate acestea, trebuie amintit că în esență toate metodele sunt genetice, deoarece rezultatul final al cartografierii este obținerea celei mai detaliate hărți a pozițiilor relative ale secvențelor structurale, funcționale și polimorfe ale genomului și determinarea distanțelor dintre ele. Prin urmare, împărțirea metodelor de cartografiere în genetică, citogenetică și fizică propusă în acest articol se bazează exclusiv pe abordările metodologice utilizate pentru a construi hărți genetice.

Hartă genetică- aceasta este cartografierea bazată pe metodele geneticii clasice - determinarea grupurilor de legături, frecvențele de recombinare și construirea hărților genetice, unde unitatea de măsură este procentul de recombinare sau centimorgani (cm). Cartografie citogeneticăCartare fizică este un grup extins de metode care face posibilă construirea de hărți ale genomului (numite de obicei hărți fizice) cu un nivel ridicat de rezoluție și determinarea distanțelor dintre secvențele de nucleotide localizate cu o precizie de câteva zeci de mii de bp. până la o pereche de nucleotide. se efectuează prin metode citogenetice, atunci când se utilizează preparate citologice pentru a localiza orice secvențe de nucleotide și a determina poziția relativă a acestora. Și, în sfârșit

Abordări strategice ale cartografierii genomului

În prezent, există trei abordări principale de cartografiere a genomilor, care diferă în momentul apariției, baza metodologică necesară și gama de posibilități: funcțională, candidată și pozițională (Fig. 1).

Orez. 1.

Până de curând, cartografierea era dominată de funcţional o abordare bazată pe prezența a priori a unor informații despre polimorfismul biochimic care stă la baza unei anumite trăsături ereditare. Din punct de vedere metodologic, o astfel de cartografiere începe cu izolarea produsului proteic al unei gene în forma sa pură. Apoi, primeri degenerați sunt selectați pentru aceasta pe baza secvenței sale de aminoacizi și este efectuată screeningul PCR a bibliotecilor genomice. Cu toate acestea, lista genelor pentru care această informație era destul de completă a fost acum practic epuizată, iar majoritatea genelor a căror funcție era cunoscută au fost deja clonate și localizate.

Aproape de funcțional și candidat cartografiere. În acest caz, informațiile despre schimbarea funcțională nu sunt suficient de complete pentru a identifica gena, dar sunt suficiente pentru a face presupuneri mai mult sau mai puțin educate despre posibili candidați, fie prin funcție, fie după poziția cromozomială. Este important de subliniat că atât în ​​abordarea funcțională, cât și în cea candidată, clonarea genelor, de regulă, precede localizarea exactă a acesteia în genom, adică. cartografiere. În aceste abordări, localizarea unei gene însemna trecerea de la funcția sa la localizarea ei pe un cromozom (poziție). Această cale este considerată a fi o expresie a strategiei de „genetică directă” și este caracteristică metodelor tradiționale de cartografiere genetică și citogenetică. Până de curând, o altă cale era practic imposibilă.

Apariția multor markeri ADN foarte polimorfi la sfârșitul anilor 1980 a făcut posibil să mergem în direcția opusă - de la harta cromozomială la funcționare. Strategia „genei inverse”, așa cum este aplicată la căutarea genelor, a fost întruchipată în pozițional cartografierea, care implică localizarea unei gene în absența oricărei informații funcționale despre aceasta. În acest caz, locul său pe hartă este stabilit pe baza rezultatelor unei analize a legăturii genei cu markeri genetici localizați anterior, iar apoi regiunea genomului de lângă marker este examinată în detaliu.

Principala limitare a abordării poziționale este rezoluția scăzută a hărților genetice - intervalul dintre doi markeri vecini în care este localizată o genă poate fi prea mare și inaccesibil pentru cartografierea fizică.

Majoritatea genelor care au fost localizate sunt caracterizate de anomalii structurale (de regulă, acestea sunt gene responsabile de bolile umane ereditare), ceea ce facilitează foarte mult etapa finală a căutării genelor - izolarea și localizarea genelor.

O modalitate de a depăși limitările cartografierii poziționale este de a combina o strategie de genetică inversă cu avantajele unei abordări candidate. Această metodă de cartografiere, numită cartografiere pozițională a candidatului, o înlocuiește treptat pe cea pozițională și constă în căutarea genelor candidate adecvate într-o regiune identificată a genomului.

Informații conexe.

Cartografierea genelor cartografierea genelor, cartografierea- cartografierea genelor.

Determinarea poziției unei anumite gene pe orice cromozom față de alte gene; utilizați trei grupuri principale de metode Kg.- fizice (determinare folosind hărți de restricție, microscopie electronică și unele variante de electroforeză a distanțelor intergenice - în nucleotide), genetice (determinarea frecvențelor de recombinare între gene, în special, în analiza familiei etc.) și citogenetice (hibridarea in situ).<hibridizare in situ>, obținând hibrizi de celule monocromozomiale<hibrid de celule monocromozomiale>, metoda de ștergere<cartografiere de ștergere> etc.); în genetica umană, sunt acceptate 4 grade de fiabilitate a localizării unei anumite gene - confirmate (stabilite în două sau mai multe laboratoare independente sau pe materialul a două sau mai multe obiecte de testare independente), preliminar (1 laborator sau 1 familie analizată), contradictoriu (discrepanță între datele de la diferiți cercetători), îndoielnic (date nespecificate definitiv dintr-un singur laborator); Anexa 5 oferă un rezumat (începând cu 1992-93) al genelor structurale, oncogenelor și pseudogenelor la om și - inclusiv unele mutații - genomului șoarecelui.

(Sursa: „Dicționar explicativ englez-rus al termenilor genetici.” Arefiev V.A., Lisovenko L.A., Moscova: Editura VNIRO, 1995)

Vedeți ce este „cartarea genelor” în alte dicționare:

cartografierea genelor- Determinarea poziției unei anumite gene pe orice cromozom față de alte gene; se folosesc trei grupe principale de metode K.g. fizice (determinare folosind hărți de restricție, microscopie electronică și unele variante de electroforeză... ...

Cartografierea genelor- determinarea poziției unei anumite gene pe orice cromozom față de alte gene. Cartografierea genetică implică determinarea distanțelor pe baza frecvențelor de recombinare dintre gene. Cartografierea fizică utilizează unele tehnici... ... Dicţionar de psihogenetică

cartografierea [genelor] folosind backcrossing- Metoda de cartografiere genetică bazată pe obținerea hibrizilor de backcross de forme înrudite și analiza divizării alelelor variante care sunt polimorfe în lungimea fragmentelor de restricție; Această metodă este cea mai comună în cartografierea genelor în... ... Ghidul tehnic al traducătorului

Cartografierea backcross [gene] folosind backcrossing. O metodă de cartografiere genetică bazată pe obținerea de hibrizi încrucișați cu forme înrudite și pe analiza divizării variantelor de alele care sunt polimorfe în lungimi de restricție... ...

Cartografierea genică comparativă a mamiferelor- * cartografierea genelor de mamifere * cartografierea comparativă a genelor de mamifere (comparație informativă a hărților genetice ale oamenilor și ale oricăror alte specii de mamifere). Trebuie să fie amândoi bine studiati și departe unul de altul...

Cartografiere- * cartografiere * cartografiere care stabilește pozițiile genelor sau ale unor situsuri specifice (vezi) de-a lungul catenei de ADN (hartă)... Genetica. Dicţionar enciclopedic

Cartografiere folosind hibrizi iradiați [celule]- * cartografierea hibrizilor [celule] dapamogay apramenennyh * modificarea cartografierii hibride radiate a metodei de cartografiere a genelor folosind hibridizarea celulelor somatice. Celulele clonei hibride „rozător-uman” care conțin doar cromozomul 1... ... Genetica. Dicţionar enciclopedic

Cartografierea hibridului de radiații folosind hibrizi iradiați [celule]. Modificarea metodei de cartografiere a genelor folosind hibridizarea celulelor somatice, celulele clonei hibride „rozător ˟ uman”, conținând doar 1 cromozom... ... Biologie moleculară și genetică. Dicţionar.

Stabilirea ordinii de localizare a genelor și distanța relativă dintre ele într-un grup de legătură... Dicționar medical mare

Hărți genetice și fizice Conform clasificării general acceptate, metodele de cartografiere a genomului sunt împărțite în două categorii: p Hartizare genetică p Hartizare fizică 2

Întocmirea hărților genetice p p Markerii sunt pozițiile oricăror caracteristici distinctive. Genele care definesc fenotipuri ușor de distins au fost folosite ca markeri de zeci de ani. Pentru hărți mai complexe, caracteristicile sale biochimice au fost folosite ca caracteristici fenotipice ale unui organism. O hartă bazată pe gene poate să nu fie foarte detaliată. De asemenea, doar o fracțiune din numărul total de gene există în forme alelice care se pot distinge în mod convenabil. 3

Markeri ADN Markerii ADN sunt caracteristici cartografice care nu sunt gene. Orice marker ADN util trebuie să aibă două alele, la fel ca o genă marker. Trei tipuri de caracteristici ale secvenței ADN satisfac această cerință: - Polimorfisme de lungime a fragmentelor de restricție (RFLP); -Polimorfisme de lungime a secvenței simple (SSLP); -Polimorfisme cu un singur nucleotide (SNP). 4

1 marker ADN. Polimorfismele de lungime de restricție RFLP sunt primul tip de marker ADN care a fost studiat pe deplin. Enzimele de restricție taie ADN-ul la anumite locuri de recunoaștere. Această specificitate înseamnă că tratarea unei molecule de ADN cu o enzimă de restricție ar trebui să producă același set de fragmente. Acest lucru nu se întâmplă întotdeauna cu moleculele de ADN genomic, deoarece unele situsuri de restricție sunt polimorfe și există sub formă de două alele: una arată secvența corectă pentru locul de restricție și, prin urmare, este tăiată de o enzimă atunci când ADN-ul este procesat, iar a doua. alela poartă o modificare a secvenței astfel încât locul de restricție nu mai este identificat. Ca rezultat, două fragmente de restricţie adiacente 5 rămân legate împreună, ceea ce

Imagistica RFLP 2. PCR este folosită mult mai frecvent. Primerii PCR sunt proiectați să se recoace pe ambele părți ale regiunii polimorfe, iar RFLP este tipat prin tratarea fragmentului propagat cu o enzimă de restricție și apoi rularea probei pe un gel de agaroză. 8

2 marker ADN. Polimorfisme de lungime a secvenței simple SSLP - seturi de secvențe repetate care prezintă modificări în lungime; diferite alele conțin un număr diferit de unități repetate. Există două tipuri de SSLP: minisateliți și microsateliți. Două variante ale unor STR (microsatelit) cu secvența repetată GA 9

Tipuri de minisateliți SSLP (număr variabil de repetări în tandem sau VNTR). Unitatea de repetare poate avea o lungime de până la 25 bp. 2. Microsateliți (repetări simple în tandem sau STR-uri). Repetați elementul – 13 bp. sau mai putin. 1. 10

Tipurile de markeri ADN SSLP bazați pe microsateliți sunt mai populare decât cei bazați pe minisateliți din două motive: - Minisateliții sunt distribuiți neuniform pe tot genomul, mai des întâlniți în regiunile telomerice de la capetele cromozomilor, microsateliții sunt mai uniform distribuiti în întregul genom. -tiparea precisă a polimorfismului de lungime prin PCR este posibilă cu lungimi de secvență de cel mult 300 bp. , iar majoritatea alelelor minisateliților sunt 11

3 marker ADN. Polimorfisme cu o singură nucleotidă SNP-urile sunt poziții genomice în care unii indivizi au o singură nucleotidă, cum ar fi G, iar alții au o nucleotidă diferită - P. 12

Majoritatea SNP-urilor au 2 alele deoarece SNP-urile apar atunci când apar mutații punctuale în genom, transformând o nucleotidă în alta. Dacă o astfel de mutație apare în celulele reproducătoare, atunci unul sau mai mulți dintre descendenții săi pot moșteni mutația și, în cele din urmă, SNP devine fixat în populație. 13

Metode de tipizare SNP Metodele se bazează pe analiza prin hibridizare a oligonucleotidelor. - Tehnologia cipului ADN - Metode de hibridizare a soluției - Analiza de ligatură a oligonucleotidelor (OLA) - Sistem termostabil de propagare a mutației sau test ARMS. 14

Metode de tipare SNP Tehnologia cipului ADN ADN-ul destinat testării, marcat cu un marker fluorescent, este pipetat pe suprafața unei plăci de sticlă de 2 cm 2 care conține multe oligonucleotide diferite. Hibridizarea este detectată prin analiza cipului folosind un microscop cu fluorescență. Pozițiile la care este emis semnalul fluorescent indică ce oligonucleotide 1. 15

Metode de tipizare SNP 2. Metoda hibridizării soluției Se utilizează o pereche de etichete, care include un colorant fluorescent și o substanță care stinge semnalul fluorescent atunci când se apropie de colorantul care îl emite. Colorantul este atașat la un capăt al oligonucleotidei, iar agentul de stingere este atașat la celălalt capăt. Dacă hibridizarea are loc între oligonucleotidă și ADN-ul de testat, atunci această împerechere a bazelor este întreruptă, stingerea este detașată de colorant și produce un semnal fluorescent. 16

Metode de tipizare SNP 3. Analiza de ligatură a nucleotidelor (OLA) Utilizează două oligonucleotide care se recoace una adiacentă, cu capătul 3’ al uneia dintre ele căzând exact în SNP. Această oligonucleotidă formează o structură complet pereche de baze dacă o versiune a SNP este prezentă în ADN-ul șablon și, atunci când se întâmplă acest lucru, această oligonucleotidă poate fi 17.

Metode de tipizare SNP 4. Sistem de propagare a mutației stabil termic (test ARMS) Oligonucleotida de control este una dintr-o pereche de primeri PCR. Dacă primerul de control se recoacă la SNP, atunci acesta poate fi continuat de polimerază Taq și poate avea loc PCR, dar dacă nu se recoacă deoarece este prezentă o versiune alternativă a SNP, atunci nu vor fi produse produse PCR.

Legătura trăsăturilor genetice Cartografierea genetică se bazează pe legile eredității descrise de Gregor Mendel încă din 1865. Pe lângă primele două legi ale lui Mendel, mai există două cazuri de legături neobișnuite: -Dominanță incompletă (forma heterozigotă prezintă un fenotip intermediar între două forme homozigote); -Codominanța (forma heterozigotă prezintă ambele fenotipuri homozigote) 19

Un pas definitoriu în dezvoltarea cartografierii genetice Când legile lui Mendel au fost redescoperite în 1900, s-a descoperit că legătura completă așteptată între multe perechi de gene nu a avut loc. Perechile de gene au fost fie moștenite independent, fie au prezentat doar o legătură incompletă: uneori au fost moștenite împreună, alteori separat. p Rezolvarea acestei contradicții a fost un pas decisiv în dezvoltarea cartografierii genetice. p 20

Raționamentul lui Thomas Morgan Legătura incompletă se explică prin comportamentul cromozomilor în timpul meiozei. p Procesul de încrucișare (sau recombinare) a fost descoperit de citologul belgian Jansen în 1909 și l-a ajutat pe Morgan să explice legătura incompletă. Luați în considerare efectul pe care încrucișarea îl are asupra moștenirii genelor. p21

Efect de încrucișare Există două scenarii posibile: p Nu are loc nicio încrucișare între genele A și B. Apoi doi gameți au genotipul AB, ceilalți doi au genotipul ab. p Încrucișarea are loc între genele A și B. Acest lucru are ca rezultat schimbul de segmente de ADN între cromozomii omologi. Ca urmare, fiecare gamet are un genotip diferit de ceilalți: AB, a. B, Ab și ab. Pe lângă gameții cu genotipuri parentale, gameții cu 22

Cartografierea genetică Când Morgan a explicat legătura incompletă ca fiind încrucișarea, el a inventat o modalitate de a mapa pozițiile individuale ale genelor pe un cromozom. Să presupunem că încrucișarea este un eveniment aleatoriu, ceea ce înseamnă că poate avea loc în orice poziție de-a lungul unei perechi de cromatide întinse una de-a lungul celeilalte. Dacă acest lucru este adevărat, atunci două gene situate aproape una de alta vor fi separate prin încrucișări mai rar decât genele care se află mai departe. Frecvența cu care genele sunt separate prin încrucișare va fi direct proporțională cu distanța dintre ele. Prin urmare, frecvența de recombinare este o măsură a distanței 23

Analiza legăturii trăsăturilor genetice la organisme de diferite tipuri. Include trei situații: p Analiza legăturii trăsăturilor genetice la specii precum musca de fructe și șoarecele cu care pot fi efectuate experimente de încrucișare; p Analiza legăturii trăsăturilor genetice la persoanele cu care nu pot fi efectuate experimente, dar pot fi studiate pedigree; p Analiza legăturii trăsăturilor genetice la bacterii care nu sunt 24

Analiza legăturii trăsăturilor genetice cu posibilitatea de încrucișare Metoda se bazează pe analiza descendenților din încrucișări experimentale cu genotipuri cunoscute ale părinților. Încrucișarea de testare este de obicei folosită. Această metodă este aplicabilă tuturor eucariotelor, dar nu este aplicabilă oamenilor din motive etice. 25

Întocmirea unei hărți genetice pe baza analizei pedigree-ului unei persoane Adesea, din cauza respectării eticii științifice și medicale, oamenii de știință pot opera doar cu date slabe, deoarece căsătoriile rareori oferă încrucișări analitice convenabile, iar genotipurile multor membri ai familiei pot fi necunoscute. din cauza morții sau a refuzului de a coopera. De obicei, pentru a rezolva problema genetică necesară, este suficient să cunoașteți în plus genotipul a cel puțin unei rude, dar din diverse motive acest lucru este imposibil. 26

Compilarea hărților genetice ale bacteriilor Principala dificultate este că bacteriile sunt haploide și nu suferă meioză. Prin urmare, sunt utilizate trei metode care pot provoca încrucișarea: p În timpul procesului de conjugare, este transferat un epizom (un segment de ADN cromozomial cu lungimea de până la 1 milion bp) p Transducție (transferul unui fragment de ADN cu lungimea de până la 50 mii bp). printr-un bacteriofag) p Transformare (celula receptor 27

Întocmirea hărților fizice O hartă obținută exclusiv prin metode genetice nu va fi complet exactă. Acest lucru se datorează următoarelor motive: 1. Rezoluția hărții genetice depinde de numărul de încrucișări care au fost recrutate. Pentru microorganisme aceasta nu este o problemă majoră, deoarece acestea pot fi obținute în orice cantitate. Problema cu oamenii și alte eucariote este că este imposibil să se obțină un număr mare de descendenți, deoarece doar 28 pot fi studiati.

Realizarea hărților fizice 2. Hărțile genetice au o acuratețe limitată. Imaginea prezintă o comparație a hărților fizice și genetice ale drojdiei Saccharomyces cerevisiae. Comparația arată că ordinea primilor doi markeri de pe harta genetică este incorectă și există, de asemenea, diferențe în 29 relative.

Compilarea hărților de restricție Cel mai simplu mod de a compila o hartă de restricție este de a compara dimensiunile fragmentelor obținute prin digerarea unei molecule de ADN cu două enzime de restricție diferite. Selectarea singurei hărți corecte permite procesarea suplimentară a ADN-ului original cu o singură enzimă, împiedicând digestia să continue până la finalizare. Aceasta se numește restricție parțială. Scara hărții de restricție este limitată de lungimea benzilor de restricție. Maparea restricțiilor este mai potrivită pentru moleculele mici. 31

Compilarea hărților de restricție Este posibil să se utilizeze analiza de restricție pentru a cartografi genomurile mai mari de 50 mii bp? ? Da, restricțiile cartografierii restricției pot fi relaxate prin selectarea enzimelor care au locuri de tăiere rare în molecula de ADN țintă („enzime de restricție cu tăiere scăzută”) 32

Metoda OFAGE Electroforeză pe gel cu câmp alternant ortogonal. Astfel, fiecare modificare a câmpului forțează moleculele să se rearanjeze, moleculele scurte se rearanjează și câmpul electric alternează migrând prin gel între cele două perechi mai repede decât cele lungi. Datorită electrozilor, fiecare dintre acestea permite ca această tehnică să fie plasată la un unghi de 45° față de fragmentele mai lungi, linia longitudinală a gelului. decât cu electroforeza convențională. Metodele de acest fel includ, de asemenea, CHEF - electroforeza pe gel cu câmpuri electrice uniforme și 33 FIGE - electroforeza pe gel cu inversare de câmp.

Observarea directă a locurilor de restricție din moleculele de ADN. Alte metode decât electroforeză pot fi utilizate pentru a mapa locurile de restricție. p Metoda de cartografiere optică: pozițiile locurilor de restricție sunt determinate prin observarea directă a moleculelor de ADN tăiate la microscop. Pentru a fixa ADN-ul pe o lamă de sticlă, se utilizează tragerea gelului și pieptănarea moleculelor. p Pentru tragerea în jos a gelului, ADN-ul cromozomial este suspendat în agaroză topită și plasat pe o lamă de microscop. Pe măsură ce gelul se răcește și se întărește, moleculele de ADN se întind. p Pentru pieptănare, fibrele de ADN sunt preparate prin scufundarea unei lame acoperite cu silicon în soluția de ADN și menținându-l acolo timp de 5 minute. Apoi, scoateți paharul din soluție. Forța necesară pentru a trage ADN-ul prin meniscul de suprafață face ca fiecare dintre ele să fie tras într-o linie. Când ADN-ul se usucă

Hibridizare fluorescentă in situ (FISH) În această tehnică, markerul este o secvență de ADN care este afișată prin hibridizare cu o sondă fluorescentă. Un cromozom netulburat este examinat prin sondarea cu o moleculă de ADN marcată. Pentru ca metoda să funcționeze, ADN-ul din cromozom este denaturat (uscat pe o lamă de sticlă și procesat 36

FISH in action 1. 2. Inițial, metoda a fost folosită cu cromozomi metafazici, dar compactarea lor puternică nu a permis hărți de înaltă rezoluție. În 1995, au fost dezvoltate o serie de metode FISH cu rezoluție mai mare. S-a realizat prin schimbarea naturii aparatului cromozomial studiat. Dacă cromozomii în metafază sunt prea comprimați pentru cartografierea la scară largă, atunci ar trebui să folosim cromozomi mai alungiți. Există două moduri de a realiza acest lucru. Cromozomii alungiți mecanic pot fi obținuți prin schimbarea metodei de preparare utilizată pentru izolarea cromozomilor din nucleele metafazate. Cromozomii non-metafazici sunt utilizați deoarece în toate etapele ciclului celular, cu excepția metafazei, cromozomii sunt în starea lor naturală desfășurată. Cromozomi de interfaza

Maparea cu etichete secvențe (STS) este în prezent cea mai puternică metodă de cartografiere fizică. Regiunea marcată cu secvență, sau STS, este o secvență scurtă de ADN, 100-500 bp. în lungime, care este ușor de identificat și apare o singură dată în cromozomul sau genomul studiat. Pentru a mapa un set de STS, este necesar să existe mai multe fragmente de ADN suprapuse dintr-un singur cromozom sau dintr-un genom complet. Care fragmente conțin care STS este determinată prin analiza de hibridizare sau, mai frecvent, PCR. Orice secvență unică de ADN poate fi utilizată ca STS. Pentru a face acest lucru, secvența ADN trebuie să fie cunoscută și STS trebuie să aibă o locație unică pe cromozomul studiat.

Metode de obţinere a STS 1. 2. 3. Etichete de secvenţă exprimată - secvenţe scurte obţinute prin analiza clonelor de ADN. Polimorfisme de lungime a secvenței simple (SSLP) Secvențe genomice aleatorii - obținute prin secvențierea porțiunilor aleatoare de ADN genomic donat. 39

Fragmente de ADN pentru cartografiere folosind STS Reactiv de cartografiere altfel; există sub forma unei biblioteci de clone și hibrizi de radiații. Un hibrid de radiații este o celulă de rozătoare care conține fragmente din cromozomii unui alt organism. Când un cromozom a fost divizat în fragmente, o doză mai mare de radiații a produs un număr mai mare de fragmente. Fuziunea este stimulată chimic (de polietilen glicol) sau biologic de virusul Sendai. 40

Concluzii p p p Hărțile genomului sunt un cadru de referință pentru proiectele de secvențiere, deoarece permit verificarea acurateței secvenței ADN asamblate. Hărțile genetice sunt construite din rezultatele experimentelor de încrucișare și ale analizei pedigree, în timp ce hărțile fizice sunt construite prin observarea directă a moleculelor de ADN. În primele hărți genetice, markerii erau gene ale căror alele puteau fi distinse cu ușurință (prin fenotipuri puternic diferite), dar astăzi markerii ADN sunt polimorfisme cu lungime a fragmentelor de restricție (RFLP), polimorfisme cu lungime a secvenței simple (SSLP) și polimorfisme cu un singur nucleotide (SNP). . Toate sunt ușor de tastat prin PCR. Analiza legăturii trăsăturilor genetice permite determinarea frecvenței recombinării între o pereche de markeri. Pentru multe organisme, analiza legăturii trăsăturilor genetice este urmărită prin 41 de experimente de încrucișare planificate. Conducerea lor cu oameni

Concluzii p p p Cartografierea genetică a genomului uman se bazează pe informațiile obținute din analiza pedigree. Rezoluția scăzută a hărților genetice este rafinată prin cartografierea fizică. Într-o moleculă de ADN, pozițiile situsurilor de restricție sunt determinate prin maparea restricției. Hibridizarea fluorescentă este mai productivă, în care medicamentul este testat cu un marker marcat cu o etichetă fluorescentă. Poziția hibridizării este determinată prin microscopie. Cele mai detaliate hărți fizice sunt obținute prin maparea conținutului de etichete secvențe (STS). Poziția markerului pe hartă este determinată de fragmente din colecția care conține copii ale markerului. 42