Микроскоп разрешение. Микроскоп, как оптический прибор. Разрешающая способность микроскопа. Классификация световых микроскопов. Применение ультрафиолетовых лучей
Световая микроскопия
Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.
Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0.2 мм.
Контраст изображения - это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 - 4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.
Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.
Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 45 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.
Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы или светосилы объектива. Светосила объектива -интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива. Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA. Если между объективом и образцом ввести жидкость (масло или, что бывает реже, дистиллированную воду), то получится «иммерсионный» объектив с величиной NA, достигающей 1,4, и с соответствующим улучшением разрешения.
Методы световой микроскопии
Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.
Метод светлого поля и его разновидности
Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.
Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.
Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.
Метод темного поля и его разновидности
Метод тёмного поля в проходящем свете (Dark-field microscopy) используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции - т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect) , известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.
Проведение темнопольного исследования
Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.
Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:
Устанавливают свет по Келеру;
Заменяют светлопольный конденсор темнопольным;
На верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или дистиллированную воду;
Поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла;
Объектив малого увеличения фокусируют на препарат;
С помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок);
Поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна.
Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол - конус света фокусируется в толще стекла).
После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.
В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип – препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать» в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц с×частиц размером до 2×10 в -9 степени м. Но форму и точные размеры таких помощью этого метода определить невозможно. Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.
Метод фазового контраста
Метод фазового контрастаи его разновидность - т. н. метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.
Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:
Набора объективов со специальными фазовым пластинками;
Конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;
Вспомогательного телескопа для настройки фазового контраста.
Настройка фазового контраста заключается в следующем:
Заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквами Ph) ;
Устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой "0");
Настраивают свет по Келеру;
Выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;
Поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;
Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые
микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры
не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.) a электронные для изучения
более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий.
Современные световые микроскопы
- это сложные оптические
приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой
аккуратности.
Световые микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные
и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой.
Отечественные микроскопы (Биолам", "Бимам", "Микмед")
имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С - студенческие,
Р - рабочие, Л - лабораторные, И - исследовательские), комплектация обозначается
цифрой.
В микроскопе различают механическую и оптическую части.
К механической части
относятся: штатив (состоящий из основания
и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления
и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления
конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого
(макромеханизм, макровинт) и тонкого
(микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.
Оптическая часть
микроскопа представлена объективами, окулярами
и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных
под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую
сторону, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются
в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение,
устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий
один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.
Принципиальная схема микроскопа и осветительной системы
1.
Источник света;
2. Коллектор;
3. Ирисовая полевая диафрагма;
4. Зеркало;
5. Ирисовая аппертурная диафрагма;
6. Конденбсор;
7. Препарат;
7". Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое; объективом;
7"". Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в
окуляре;
8. Объектив;
9. выходной значок объектива;
10. Полевая диафрагма окуляра;
11. Окуляр;
12. Глаз.
Основную роль в получении изображения играет объектив
. Он
строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем
это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр,
который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.
Увеличение
микроскопа ориентировочно можно определить, умножая
увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет
качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей
способностью микроскопа
, т. е. возможностью различать раздельно две
близко расположенные точки. Предел разрешения
- минимальное
расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно,- зависит от длины волны
света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая
апертура, в свою очередь, зависит от угловой апертуры объектива и показателя
преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом.
Угловая апертура-это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив
лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления
среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления
стекла, тем выше разрешающая способность объектива. Если считать апертуру
конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет
следующий вид:
где R - предел разрешения; - длина волны; NA - числовая апертура.
Различают полезное
и бесполезное
увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива,
увеличенной в 500-1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет
новых деталей и является бесполезным.
В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают
«сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с
максимальной апертурой и увеличением (90-100 х). «Сухой» объектив - это такой
объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом, находится воздух.
Особенностью иммерсионных объективов является то, что между
фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость,
имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему),
что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива.
В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют
дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии-кедровое масло или
специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического
иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно
нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной
линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра,
в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Ни в коем случае нельзя
пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом.
**Изображение, полученное с помощью линз, обладает различными недостатками:
сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др.
В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной
мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков различают
объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Соответственно объективы, в
которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и
планапохроматами. Использование этих объективов позволяет получить резкое
изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных
объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения.
Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное
увеличение, апертура, тип объектива (АПО - апохромат и т. п.); объективы водной
иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части,
объективы масляной иммерсии-обозначение МИ и черное кольцо.
Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17мм.
Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе
с сильными сухими системами (40 х). При работе с иммерсионными объективами
нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина
покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива,
и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть
повреждена фронтальная линза объектива.
Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых
применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки
изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.
Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от
осветителя, направляемый зеркалом микроскопа или осветителя (в случае использования
накладного или встроенного осветителя). Одной из деталей конденсора является
апертурная диафрагма, которая имеет важное значения для правильного освещения
препарата.
Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, трансформатора,
коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия, которой зависит диаметр
освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор.
Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор,
необходимо использовать только плоскую сторону зеркала.
Настройка освещения н фокусировка микроскопа
Качество изображения в значительной мере зависит также от
правильного освещения. Существует несколько различных способов освещения препарата
при микроскопии. Наиболее распространенным является способ установки
света по Келеру
, который заключается в следующем:
1) устанавливают осветитель против зеркала микроскопа;
2) включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа;
3)помещают препарат на предметный столик микроскопа;
4) закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем изображение
нити лампы, передвигая патрон лампы в осветителе;
5) убирают лист бумаги с зеркала;
6) закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слегка передвигая
патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной диафрагме. Расстояние
осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было
равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора (наблюдать апертурную диафрагму
можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроскопа).
7)открывают апертурную диафрагму конденсора, уменьшают отверстие полевой диафрагмы
осветителя и значительно уменьшают накал лампы;
8) при малом увеличении (10х), глядя в окуляр, получают резкое изображение
препарата;
9)слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы, которое
имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор,
добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы в плоскости
препарата (вокруг них может быть видна цветная каемка);
10) раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают
накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы
конденсора;
11)при смене объектива необходимо проверить настройку света.
После окончания настройки света по Келеру нельзя изменять положение конденсораf
раскрытие полевой и апертурной диафрагмы. Освещенность препарата можно регулировать
только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата.
Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному
снижению контраста изображения, а недостаточное - к значительному ухудшению
качества изображения (появлению диффракционных колец). Для проверки правильности
раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус,
открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на одну треть.
Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения
(до 10х) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.
Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение - с сильными
сухими (40х) и иммерсионными (90х) системами, чтобы не повредить фронтальную
линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбоку, опускают
объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в
окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения
и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.
Уход за микроскопом
При работе с микроскопом нельзя применять большие усилия.
Нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров.
Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса
от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке
внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой
в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной,
не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной
чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется
протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию.
С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее
резиновой грушей. Протирать их нельзя. Нельзя также самостоятельно развинчивать
и разбирать объективы - это приведет к их порче. По окончании работы на микроскопе
необходимо тщательно удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы
объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор
в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.
Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать
его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином и затем сухой
мягкой чистой тряпкой.
Помимо обычной световой микроскопии существуют методы микроскопии, позволяющие изучать неокрашенные микроорганизмы: фазово-контрастная , темнопольная и люминесцентная микроскопия. Для изучения микроорганизмов и их структур, размер которых меньше разрешающей способности светового микроскопа используют
Микроскоп предназначен для наблюдения мелких объектов с большим увеличением и с большей разрешающей способностью, чем дает лупа. Оптическая система микроскопа состоит из двух частей: объектива и окуляра. Объектив микроскопа образует действительное увеличенное обратное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра. Окуляр действует как лупа и образует мнимое изображение на расстоянии наилучшего видения. По отношению ко всему микроскопу рассматриваемый предмет располагается в передней фокальной плоскости.
Увеличение микроскопа
Действие микрообъектива характеризуют его линейным увеличением: V об =-Δ/F\" об * F\" об - фокусное расстояние микрообъектива * Δ - расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра, называемое оптическим интервалом или оптической длиной тубуса.
Изображение, создаваемое объективом микроскопа в передней фокальной плоскости окуляра рассматривается через окуляр, который действует как лупа с видимым увеличением:
G ок =¼ F ок
Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра: G=V об *G ок
Если известно фокусное расстояние всего микроскопа, то его видимое увеличение можно определить так же, как и у лупы:
Как правило, увеличение современных объективов микроскопов стандартизованное и составляет ряд чисел: 10, 20, 40, 60, 90, 100 крат. Увеличения окуляров тоже имеют вполне определенные значения, например 10, 20, 30 крат. Во всех современных микроскопах имеется комплект объективов и окуляров, которые специально рассчитываются и изготавливаются так, что подходят друг к другу, поэтому их можно комбинировать для получения разных увеличений.
Поле зрения микроскопа
Поле зрения микроскопа зависит от углового поля окуляра ω , в пределах которого получается изображение достаточно хорошего качества: 2y=500*tg(ω)/G * G - увеличение микроскопа
При данном угловом поле окуляра линейное поле микроскопа в пространстве предметов тем меньше, чем больше его видимое увеличение.
Диаметр выходного зрачка микроскопа
Диаметр выходного зрачка микроскопа вычисляется следующим образом:
где A – передняя апертура микроскопа.
Диаметр выходного зрачка микроскопа обычно немного меньше диаметра зрачка глаза (0.5 – 1 мм).
При наблюдении в микроскоп зрачок глаза нужно совмещать с выходным зрачком микроскопа.
Разрешающая способность микроскопа
Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность. Согласно дифракционной теории Аббе, линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:
Предельно достижимую разрешающую способность оптического микроскопа можно сосчитать, исходя из выражения для апертуры микроскопа . Если учесть, что максимально возможное значение синуса угла – единичное , то для средней длины волны можно вычислить разрешающую способность микроскопа:
Повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: * Увеличивая апертуру объектива, * Уменьшая длину волны света.
Иммерсия
Для того чтобы увеличить апертуру объектива, пространство между рассматриваемым предметом и объективом заполняется так называемой иммерсионной жидкостью – прозрачным веществом с показателем преломления больше единицы. В качестве такой жидкости используют воду , кедровое масло , раствор глицерина и другие вещества. Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины , тогда предельно достижимая разрешающая способность иммерсионного оптического микроскопа составит.
Применение ультрафиолетовых лучей
Для увеличения разрешающей способности микроскопа вторым способом применяются ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей. При этом должна быть использована специальная оптика, прозрачная для ультрафиолетового света. Поскольку человеческий глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение, необходимо либо прибегнуть к средствам, преобразующим невидимое ультрафиолетовое изображение в видимое, либо фотографировать изображение в ультрафиолетовых лучах. При длине волны разрешающая способность микроскопа составит.
Кроме повышения разрешающей способности, у метода наблюдения в ультрафиолетовом свете есть и другие преимущества. Обычно живые объекты прозрачны в видимой области спектра, и поэтому перед наблюдением их предварительно окрашивают. Но некоторые объекты (нуклеиновые кислоты, белки) имеют избирательное поглощение в ультрафиолетовой области спектра, благодаря чему они могут быть «видимы» в ультрафиолетовом свете без окрашивания.
Разрешающая способность глаза ограничена. Разрешающая способность характеризуется разрешаемым расстоянием , т.е. минимальным расстоянием между двумя соседними частицами, при котором они еще видимы раздельно. Разрешаемое расстояние для невооруженного глаза составляет около 0,2 мм. Для увеличения разрешающей способности используют микроскоп. Для исследования строения металлов микроскоп был впервые применен в 1831 году Аносовым П.П., изучавшим булатную сталь, и позднее, в 1863 году англичанином Г. Сорби, изучавшим метеоритное железо.
Разрешаемое расстояние определяется соотношением:
где l - длина волны света, идущего от объекта исследования в объектив, n – показатель преломления среды, находящейся между объектом и объективом, и a - угловая апертура, равная половине угла раскрытия, входящего в объектив пучка лучей, дающих изображение. Эта важная характеристика объектива выгравирована на его оправе.
У хороших объективов максимальный апертурный угол a = 70° и sina » 0,94. В большинстве исследований применяют сухие объективы, работающие в воздушной среде (n = 1). Для уменьшения разрешаемого расстояния используют иммерсионные объективы. Пространство между объектом и объективом заполняют прозрачной жидкостью (иммерсией) с большим показателем преломления. Обычно используют каплю кедрового масла (n = 1,51).
Если для видимого белого света принять l = 0,55 мкм, то минимальное разрешаемое расстояние светового микроскопа:
Таким образом, разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной волны света. Объектив дает увеличение промежуточного изображения объекта, которое рассматривается в окуляр, как в лупу. Окуляр увеличивает промежуточное изображение объекта и не может повысить разрешающей способности микроскопа.
Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений объектива и окуляра. На металлографических микроскопах производят исследования структуры металлов с увеличением от 20 до 2000 раз.
Начинающие делают обычную ошибку, стремясь рассматривать структуру сразу же при большом увеличении. Следует иметь в виду, что чем больше увеличение объекта, тем меньший участок виден в поле зрения микроскопа. Поэтому рекомендуется начинать исследование с использования слабого объектива, чтобы вначале оценить общий характер структуры металла на большой площади. Если же начинать микроанализ с использования сильного объектива, то многие важные особенности структуры металла могут быть не замечены.
После общего просмотра структуры при малых увеличениях микроскопа выбирают объектив с такой разрешающей способностью, чтобы увидеть все необходимые самые мелкие детали структуры.
Окуляр выбирают так, чтобы четко были видны детали структуры, увеличенные объективом. При недостаточном увеличении окуляра мелкие детали промежуточного изображения, созданного объективом, не будут увидены в микроскоп, и, таким образом, разрешающая способность объектива полностью не будет использована. При слишком большом увеличении окуляра новые детали структуры не выявляются, в то же время контуры уже выявленных деталей окажутся размытыми, а поле зрения станет более узким. Собственное увеличение окуляра выгравировано на его оправе (например, 7 х).
Технически возможно создать оптические микроскопы, объективы и окуляры которых дадут общее увеличение 1500-2000 и больше. Однако это нецелесообразно, так как возможность различить мелкие детали предмета ограничивается дифракционными явлениями. Вследствие этого изображение мельчайших деталей предмета теряет резкость, может возникнуть нарушение геометрического подобия изображения и предмета, соседние точки будут сливаться в одну, возможно полное исчезновение изображения. Поэтому в оптике существуют следующие понятия, которые характеризуют качество микроскопа:
Разрешающая способность микроскопа - свойство микроскопа давать раздельно изображение мелких деталей рассматриваемого предмета.
Предел разрешения - это наименьшее расстояние между двумя точками, которые видны в микроскопе раздельно.
Чем меньше предел разрешения, тем выше разрешающая способность микроскопа!
Предел разрешения обусловливает наименьший размер деталей, которые могут различаться в препарате с помощью микроскопа.
Теорию разрешающей способности микроскопа разработал директор завода К.Цейса в Йене профессор-оптик Э.Аббе (1840-1905). В качестве простейшего микропрепарата он взял дифракционную решетку (рис. 2), изучил механизм формирования изображения в микроскопе и показал следующее.
Введем понятиеапертурного угла - это угол между крайними лучами конического светового пучка, идущего от середины объекта в объектив (рис. 3,а ). Для создания изображения, то есть для разрешения объекта, достаточно, чтобы в объектив попали лучи, образующие максимумы только нулевого и первого порядка хотя бы с одной стороны (рис. 2 и 3,б ). Участие в образовании изображения лучей от большего количества максимумов повышает качество изображения, его контраст. Поэтому лучи, образующие эти максимумы, должны быть в пределах апертурного угла объектива.
 |
а) б) в) г)
1- фронтальная линза объектива, 2 - объектив
Таким образом, если объектом является дифракционная решетка с периодом d и свет падает на нее нормально (рис.2 и 3,б ), то в формировании изображения обязательно должны участвовать лучи, образующие максимумы нулевого и первого порядков с обеих сторон, а угол j 1 - угол отклонения лучей, образующих максимум первого порядка, соответственно должен быть, в крайнем случае, равен углу U /2.
Если же взять решетку с меньшим периодом d ’, то угол j’ 1 будет больше угла U /2 и изображение не возникнет. Значит период решетки d можно принять за предел разрешения микроскопа Z . Тогда, используя формулу дифракционной решетки, запишем для k =1:
Заменяя d на Z , а j 1 на U /2, получим
. (6)
Во время микроскопии световые лучи падают на объект под разными углами. При наклонном падении лучей (рис.3,г ) предел разрешения уменьшается, так как в формировании изображения будут участвовать только лучи, образующие максимумы нулевого порядка и первого порядка с одной стороны, а угол j 1 будет равен апертурному углу U . Расчеты показывают, что формула для предела разрешения в этом случае принимает следующий вид:
. (7)
Если пространство между объектом и объективом заполнить иммерсионной средой с показателем преломления n , который больше показателя преломления воздуха, то длина волны света l n = l ¤ n . Подставляя это выражение в формулу для предела разрешения (7), получим
, или 
. (8)
Таким образом, формула (7) определяет предел разрешения для микроскопа с сухим объективом, а формула (8) -для микроскопа с иммерсионным объективом. Величины sin 0,5U и n× sin0,5U в этих формулах называют числовой апертурой объектива и обозначают буквой А . Учитывая это, формулу предела разрешения микроскопа в общем виде записывают так:
Как видно из формул (8) и (9), разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны света, величины апертурного угла, показателя преломления среды между объективом и объектом, угла падения световых лучей на объект, но она не зависит от параметров окуляра. Окуляр никакой дополнительной информации о структуре объекта не дает, качества изображения не повышает, он лишь увеличивает промежуточное изображение.
Разрешающая способность микроскопа может быть повышена за счет использования иммерсии и уменьшения длины волны света. Повышение разрешающей способности при использовании иммерсии можно пояснить следующим образом. Если между объективом и объектом находится воздух (сухой объектив), то световой луч при переходе из покровного стекла в воздух, среду с меньшим показателем преломления, значительно изменяет свое направление в результате преломления, поэтому меньше лучей попадает в объектив. При использовании иммерсионной среды, показатель преломления которой приблизительно равен показателю преломления стекла, изменение хода лучей в среде не наблюдается и большее количество лучей попадает в объектив.
В качестве иммерсионной жидкости берут воду (n =1,33), кедровое масло (n =1,515) и др. Если максимальный апертурный угол у современных объективов достигает 140 0 , то для сухого объектива А =0,94, а для объектива с масляной иммерсией А =1,43. Если при расчете использовать длину волны света l = 555 нм, к которой наиболее чувствителен глаз, то предел разрешения сухого объектива составит 0,30 мкм, а с масляной иммерсией - 0,19 мкм. Значение числовой апертуры указывается на оправе объектива: 0,20; 0,40; 0,65 и др.
Повышение разрешающей способности оптического микроскопа за счет уменьшения длины волны света достигается при использовании ультрафиолетового излучения. Для этого имеются специальные ультрафиолетовые микроскопы с кварцевой оптикой и приспособлениями для наблюдения и фотографирования объектов. Так как в этих микроскопах используется свет с длиной волны примерно в два раза меньше, чем у видимого света, то они способны разрешать структуры препарата размерами около 0,1мкм. Ультрафиолетовая микроскопия имеет еще одно преимущество - с ее помощью можно исследовать неокрашенные препараты. Большинство биологических объектов прозрачны в видимом свете, так как не поглощают его. Однако они обладают избирательным поглощением в ультрафиолетовой области и, следовательно, легко различимы в ультрафиолетовых лучах.
Наибольшая разрешающая способность у электронного микроскопа, так как длина волны при движении электрона в 1000 раз меньше длины световой волны.
Полезное увеличение микроскопа ограничено его разрешающей способностью и разрешающей способностью глаза.
Разрешающая способность глаза характеризуется наименьшим углом зрения, при котором человеческий глаз еще различает раздельно две точки предмета. Она лимитируется дифракцией на зрачке и расстоянием между светочувствительными клетками сетчатки. Для нормального глаза наименьший угол зрения равен 1 минуте. Если предмет находится на расстоянии наилучшего зрения - 25 см, то этот угол соответствует предмету размером 70 мкм. Данную величину считают пределом разрешения невооруженного глаза Z r на расстоянии наилучшего зрения. Однако показано, что оптимальная величина Z r равна 140-280 мкм. При этом глаз испытывает наименьшее напряжение.
Полезным увеличением микроскопа называют его максимальное увеличение, при котором глаз еще в состоянии различать детали, равные по величине пределу разрешения микроскопа.
Линейное увеличение микроскопа равно отношению величины изображения предмета, расположенного на расстоянии наилучшего зрения, к величине самого предмета (см. формулу 1). Если за размер предмета примем предел разрешения микроскопа Z , а за размер изображения - предел разрешения невооруженного глаза на расстоянии наилучшего зрения Z r , то получим формулу полезного увеличения микроскопа:
Подставляя в эту формулу Z из выражения (9), получим
. (11)
Подставив в формулу (11) длину волны света 555 нм (555×10 -9 м), оптимальные величины пределов разрешения глаза 140-280 мкм (140-280×10 -6 м), найдем интервал значений полезного увеличения микроскопа
500 А < К п < 1000 А .
Например, при использовании лучших иммерсионных объективов с числовой апертурой 1,43 полезное увеличение будет составлять 700-1400, отсюда видно, что конструировать оптические микроскопы с большим увеличением нецелесообразно. Однако в настоящее время этот вопрос потерял свою остроту в связи с широким использованием в биологии и медицине электронного микроскопа, обеспечивающего увеличение до 600 000, а предел разрешения - до 0,1 нм.
